细胞培养技术篇——细胞冻存与复苏

细胞冻存和复苏技术是细胞培养过程中较为基础的实验操作，此举对于细胞的保种以及细胞活力的维持有着重要意义，下面就细胞冻存及复苏过程中的一些理论及实践拿来与大家分享。 细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。常用的冻存保护剂为二甲基亚砜（DMSO）和甘油，冻存细胞时加入保护剂，一方面可以提高细胞膜对水的通透性，另一方面使冰点降低，延缓冻结过程。缓慢冻存细胞的过程中，加入保护剂可以使细胞内水分渗出到细胞外，一定程度上减少胞内冰晶的产生，而在快速复苏细胞的过程中，能使胞外冰晶迅速融化，防止水分渗入胞内再次形成冰晶而损伤细胞。 目前来讲，大多数细胞冻存时均采用DMSO作为保护剂，部分细胞因对DMSO毒性敏感，可以选用甘油作为冻存保护剂。另有CEM及K562细胞实验表明加入保护剂的细胞存活率明显高于不加保护剂的，而采用甘油保护剂组的细胞较DMSO组细胞也呈现较高的存活率。 细胞冻存的常规程序为： 1、配置含10%-15%（常见为10%）的DMSO或甘油，含10%-20%血清的冻存培养液； 一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖，白蛋白等从而更好地保护细胞。有人亲测10%血清冻存细胞，结果证明是可以的，但高血清比例的冻存液更有助于提高细胞活力，此外娇贵的细胞可以适当提高冻存液中血清的比例以保证获得更高的存活率及活力。我们用的冻存液配方含10%的DMSO，40%的血清及50%的完全培养基，复苏细胞后细胞状态良好。 2、取增殖期细胞胰酶消化下转移至离心管，离心富集细胞，悬浮细胞则直接转移至离心管离心富集即可； 细胞最好处于对数生长期，而汇合度最少到50%以上，其他状态的细胞也可冻存，但是复苏时存活率会大大降低。 3、用配好的冻存液重悬细胞，并调节细胞密度至5×106/ml-1×107，转移至冻存管中； 具体冻存密度因细胞不同而异，高密度或者低密度对细胞成活率都有一定的影响。此阶段细胞最好放于冰上或4℃，尽量减少细胞的常温代谢活动。 4、细胞冻存：常见的方法主要有两大类，一类为传统方法，另一类为程序降温； 4.1、传统方法：冻存管置于4℃ 10 min → -20℃ 30 min → -80℃ 16-18 小时（或过夜）→ 转移至液氮长期储存。 细胞置于4℃及-20℃的时间不必太长，且从4℃转移至-20℃时，最好颠倒混匀下细胞，防止细胞大量沉降堆积至管底，影响细胞复苏。 4.2、程序降温：将细胞转移至细胞渐冻盒后放于-80℃冰箱过夜或置于渐冻仪中以1-2℃/min的降温速率将至-100℃后，再将细胞转移至液氮长期保存； 此过程的核心就是：缓降。因此，有人在冻存管外面包裹一团拳头大小的棉花，将细胞转移至-80℃冰箱过夜后，次日直接转移到液氮，这种简易的做法也是可行的。还有将-80℃冰箱过夜后，又增加了一步将细胞悬挂于液氮液面上一段时间，再转移至液氮，这种做法也可以一定程度上提高细胞的存活率。 细胞复苏的常规程序为： 1、 快速解冻，液氮中取出冻存细胞后，迅速放入37℃水浴中，轻轻摇动细胞，待其全部融化； 为使冻存管快速解冻，此过程中水浴温度可以也调整至40℃，边晃动边观察，待冻存管中残留有小块冰时，停止即可，此时冻存管中细胞仍维持在0℃左右，甚至有经验丰富的大神直接用将近60℃的水浴复苏细胞，复苏后细胞状态也挺好。细胞复苏要迅速，一般要求在1min左右，而且为减少DMSO的细胞毒性，尽量保证在3min以内完成细胞解冻。 2、 解冻后的细胞可直接接种到含完全培养基的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再更换新鲜完全培养液，以去除旧培养液中的DMSO。 为进一步减少DMSO的细胞毒性，待细胞解冻后可以将细胞缓慢加至含培养基于离心管中，此举一方面可以稀释DMSO的浓度，另一方面也可以使细胞缓慢适应培养基的生长环境，离心弃上清，重悬细胞后再将细胞接种至培养瓶中，次日换液。需要注意的是很多人认为是次日换液这一步既浪费培养基又费时费力，没有这种必要，曾经一位细胞库的专家在谈到细胞复苏时则专门强调这件似乎“无足轻重”的举措，故这一操作对于细胞复苏的重要性可见一斑。 希望各位战友在操作中多多积累经验，多多注意细节，细胞技术更上一层楼。