GUOYU--精读文献--2019.03.30

本周我阅读的文章是关于分子伴侣Cpka和Cpkb的相关内容，因之前对于文献的阅读不是很精通，这篇文章对我的课题及实验有很大的帮助，所以本周选择这篇文章作为我的文献精读，有帮助与我对肝素酶和Cpka和Cpkb的蛋白表达及纯化有所帮助。

《A Mutant Chaperonin That Is Functional at Lower Temperatures Enables Hyperthermophilic Archaea To Grow under Cold-Stress Conditions》

《在较低温度下起作用的突变伴侣蛋白使得嗜热古菌在冷胁迫条件下生长》、

影响因子： 3.219PMID：26013483期刊年卷：J. Bacteriol. 2015 Aug;197(16)DOI：10.1128/JB.00279-15 作者列表: GaoL, ImanakaT, FujiwaraS,

Thermococcus kodakarensis菌在85°C时生长最佳，并具有两个伴侣蛋白，冷诱导型CpkA和热诱导型CpkB，分别参与低温和高温适应。除了C-末端区域外，这两个伴侣蛋白具有高序列同一性（77％）。 CpkA含有GGM基序的串联重复序列，在60°C至70°C时显示出最高的ATP酶活性，而CpkB在高于90°C的温度下显示出最高的活性。

1.为了阐明在较低温度下ATP酶活性变化对伴侣蛋白功能的影响，通过将单点突变引入C-末端区域来构建各种CpkA变体。其中Glu530被Gly（CpkA-E530G）取代的CpkA变体显示出增加的ATP酶活性，其在50℃下具有最高活性。

2.然后在体外检查CpkA变体对作为CpkA靶的T.kodakarensis（TrpCTk）的变性吲哚-3-甘油 - 磷酸合酶的功效。CpkA-E530G比野生型CpkA更有效，促进化学解折叠的TrpCTk在50°C下的重折叠。

3.然后通过将cpkA-E530G引入T.kodakarensis KU216（pyrF）的基因组中来检查cpkA-E530G对细胞生长的影响。突变菌株DA4（pyrF cpkA-E530G）在60℃下与亲本KU216菌株一样生长。 相比之下，DA4在50°C时比KU216更有活力。

这些结果表明，CpkA-E530G突变阻止了蛋白质在冷胁迫条件下的冷变性，从而使细胞能够在较冷的环境中生长。因此，伴侣蛋白基因中的单碱基对取代允许细胞在新环境中剧烈生长。

与细菌伴侣蛋白一样，古菌伴侣蛋白单体包含三个结构域：

顶端结构域（结合未折叠的蛋白质）

中间域（它起到铰链的作用，从而允许顶端结构域的运动以及伴侣蛋白功能所需的反式和顺式构象之间的转换)

赤道域（负责环状复合体中心腔中的ATP酶和重折叠活动）。

然而，热体不具有共伴侣蛋白，例如GroES。 相反，顶端区域存在保守突出，这可能在引导未折叠的蛋白质中发挥作用。

本次实验的大概思路

构建重组质粒

将pCPAE用作模板。通过定点诱导产生cpkA变体（编码E530G，E530M，Q533G，Q533M，P538G，P538M，D545G和D545M突变）的表达质粒。为了构建pCPAE-E530G，使用原始cpkA-E530G-Fw和cpkA-E530G-Rv进行PCR，并将扩增的DNA连接到pCPAE中。用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α细胞，从阳性转化体中提取质粒DNA。然后将质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）RIL细胞中。

蛋白表达与纯化

重组CpkA及其突变体在25°C的大肠杆菌BL21(DE3)RIL中得到表达(20)。在85°C热处理30min后，CpkA及其变异体仍保留在可溶性组分中。进一步纯化采用阴离子交换层析(日本东京GE Healthcare公司，MonqHR5/5)，然后在Superdex200柱(GE Healthcare)上进行凝胶过滤。

实验结果及其分析

我们检测了每种纯化蛋白的热稳定性。以5°C·min~(-1)的速率测定了纯化蛋白在222 nm处的CD值随温度从20°C升高到100°C时的热变性曲线。得到，CpkA-E530M、-Q533M、-P538M和-D545G的热展开图与野生型CpkA非常相似。CpkA-E530G和-Q533M的热稳定性略低于野生型CpkA，而CpkA-P538G和-D545M的热稳定性略高于野生型CpkA。

突变对ATP酶活性的影响。

图3A显示，在50°C温度下，CpkA-E530G的ATP酶活性最高，几乎是相同温度下CpkA酶活性的4倍；图3A显示，在50°C温度下，CpkA-E530G的ATP酶活性最高，约为CpkA-E530G的4倍。CpkA-E530M在70°C时活性最强，但几乎是野生型CpkA的一半。50°C时CpkA-E530M的ATP酶活性略低于野生型CpkA。CpkA-Q533G在50°C时活性最强，但与野生型CpkA相似。在80°C时，CpkA-Q533M的最适活性为野生型CpkA的4倍(图1)，在此温度下，CpkA-Q533M的最适活性为野生型CpkA-Q533M的4倍。（图3B）。CpkA-P538G的ATP酶活性比CpkA-P538G低近2倍，但表现出与CpkA相似的温度依赖性。CpkA-P533M在70°C时活性最好，与野生型CpkA的活性相近(图1)。（图3C）。在60°C时，CpkA-D545G的活性最高，与野生型CpkA的活性相当。在70°C下测得CpkA-D545M的最适活性，其活性与野生型CpkA相当(图1)图3D。

突变对伴侣蛋白活性的影响。

总的来说，这些变异株的伴侣蛋白活性与它们的ATP酶活性是一致的(图1)。3)，即较高的ATP酶活性相当于较高的伴侣活性。

菌株KU216和DA4的生长曲线及生长比较试验结果。

在85°C时，DA4在对数生长期的生长速率略高于KU216(图5A)。在60°C时，DA4生长曲线的滞后期略有缩短(图5B)。然而，在50°C时，DA4的滞后时间比KU216要短得多。菌株DA4比菌株KU216早30 h开始繁殖，并比菌株KU216早近80 h达到稳定期(图5C)。这些结果表明菌株DA4在冷胁迫环境中具有生长优势。