实验动物的安乐死（啮齿动物、兔、鱼）和人道终点的选择

实验动物安乐死

1. 目的

从人道主义和动物保护角度，在不影响实验结果的同时，尽快让动物无痛苦死去。安乐死应具有保证实验动物在死去时中枢神经系统立即达到对痛觉的早期抑制，操作时能快速导致意识丧失。

2.安乐死（euthanasia），以科学人道的理念和方式，使动物生理和心理痛苦最小化而采取的动物意识迅速丧失的处死过程。

3 实验动物安乐死操作

3.1 总则

安乐死必须是人道的，可使动物无疼痛、恐惧、焦虑和不安地失去知觉和意识，直至死亡；作用快，可缩短动物从失去知觉和意识到死亡的时间；容易操作，科学可靠且能重复；操作过程不影响操作人员情绪、健康和安全；安乐死过程不可逆转;与动物的年龄、品系、健康状况和数量相适应；对药物滥用无大的潜在危险；对环境无污染或无有害影响；所用设备方使易得,便于维护适合；科学研究中不同实验需求和目的涉及取材检查等后续操作时，安乐死方法还需要不引起组织的化学变化；不增加组织的化学负荷；不引起会干涉其后研究工作的组织病理学变化；所有安乐死方法实施后确认动物死亡，必要时要配合使用第二种安乐死方法予以确认，如可在安乐死执行后，再通过放血或取出心脏，毁损大脑、断头、切除内脏来确保实验动物死亡。

3.2 实施条件

在达到以下条件时，可实施安乐死:

a)得到实验结果或动物实验结束:

b) 经实验动物医师结合动物的体重、食欲、感染、肿瘤、濒死症状等，评估判定，动物痛苦程度达到或超过预设的仁慈终点:

c) 其他原因不适合继续饲养

3.3 操作方法

3.3.1注射药物安乐死：静脉注射安乐死药物-戊巴比妥钠，作为安乐死的首选方法，为了控制人滥用药物的潜在危害性，戊巴比妥钠已列入二类精神类药物进行严格管控。也可以选择在动物麻醉后，静脉注射氯化钾。在不便使用安乐死药物时，也可选取其他合适的安乐死方法。

3.3.2 吸入麻醉性气体安乐死，14日龄以上的小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠，可以通过在不拥挤的箱中暴露于40%二氧化碳气体的方法处死，在通风良好的房间内，向未灌注二氧化碳的可透视处死箱内放入动物,以每分钟替换安乐死箱容积的 10%~30%的速度（相比国标，AVMA建议加严到30-70%，增加动物丧失意识的速度，以降低二氧化碳溶于亲水组织给动物带来的痛苦）将二氧化碳灌注到箱内，暴露5min（20日龄以上）或10min（15~20日龄），确定动物不动不呼吸、瞳孔放大。关闭二氧化碳,再观察 2 min~3 min(豚鼠观察5min),确定动物死亡。二氧化碳安乐死的动物有肺出血等改变，对病理制片有影响。乙醚虽有效，但其易燃易爆性对操作人员具有危险性，乙醚处死动物的尸体也有爆燃的危险性，不推荐用乙醚安乐死。

3.3.3 物理性安乐死

剖性状适合使用的动物，或其他安乐死方法影响实验结果的动物，可采用颈椎脱白、断颈、放血等物理方式安乐死。操作人员需手法熟练。麻醉后采血或放血的安乐死操作比较常用；因实验需求，如注射或吸入安乐死影响观察指标，无法使用化学药物或二氧化碳时，可在IACUC审核后使用清醒断头法。

表1啮齿动物和家兔的安乐死方法

注1:Y--建议使用;X--不得使用:N--不推荐,除非实验需要(操作人员操作熟练并通过IACUC审核).

注2：1meq氯化钾约为74.55mg

注3：家兔有憋气的习性，吸入二氧化碳气体前最好先麻醉。

注4：脱颈操作前，可给予动物镇静剂，减少应激

（AVMA允许兔麻醉后静脉注射空气栓塞处死，但国标无说明。）

表2 幼年啮齿动物的安乐死方法

注1:Y--建议使用;X--不得使用:N--不推荐,除非实验需要(操作人员操作熟练并通过IACUC审核).

注2：因为新生动物对缺氧耐受力强，7日龄~14日龄啮齿动物，在二氧化碳暴露20min后断头；1日龄~7日龄啮齿动物，在二氧化碳暴露60min后断头。

3.4其他操作注意事项：

斑马鱼适用于液氮低温冷冻或急速降温的方法进行安乐死。成年鱼沉浸在盐酸苯佐卡因水中（≧100 mg/l）过量麻醉致死也可接受。脑脊髓刺毁法需要操作人员操作熟练并通过IACUC审核。

动物安乐死时应在远离存活动物的非公开场所执行。

确认动物死亡后，方可妥善处置尸体。动物尸体以不透明的感染性物质专用塑料袋（黄色）包装、储藏至冷冻柜后，委托有资质的单位取走处理。

在动物使用与管理体系中，实验动物医师在动物研究中的仁慈终点具有极为关键的作用，实验动物医师有权对任何濒死或达到IACUC方案认可的人道终点的动物实施安乐死。

（因为我的单位，实验室只养大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、兔，所以国标GB∕T 39760-2021中关于犬、小型猪等大型动物的安乐死内容未列入；实验室没有气体麻醉剂，国标中异氟烷等麻醉气体安乐死未列入；戊巴比妥钠受管控，单位早就不买了，麻醉动物已经用别的非管控药物代替，所以国标中戊巴比妥钠安乐死的具体方法未列入。）

人道终点

1. 目的

体现动物实验中的福利及“3R”原则，“优化”动物实验策略，给与实验动物人道主义关爱，按照权衡性原则、最小伤害化原则和持续优化原则，设置“人道终点”，帮助判断安乐死时机，予以动物合理的死亡节点，帮助动物减少临终疼痛和应激。

2. 人道终点（Humane Endpoints)

人道终点或称仁慈终点、人道终止时机，即考虑人道对待动物的要求和实验要求，合理终止动物用于实验的时机（GB/T 27416-2014）。在不影响实验结果判定的前提下，“人为”确定一个节点( 或阶段) 并依此节点及时终止动物实验。

3. 评价指标

3.1 总则

“达到研究目的”不是实施人道终点的必要条件，当动物遭受的疼痛或痛苦达到预定指标和级别，即使实验尚未达到预期目标，也应考虑提前结束实验；而决定“是否提前结束实验”必须经过严谨的分析，对动物造成的伤害与研究价值之间进行取舍。

评价指标包括通用指标和特定研究的指标；动物实验评估人员根据实验特点，选择合适的指标，以充分反映动物实验过程中所承受的疼痛、痛苦、疾病、焦虑等指标，作为评价指标。

人道终点评价指标一般包括适用于多数实验动物的通用性指标和适用于特定研究项目的特定性指标两部分。

3.2 通用指标

3.2.1疼痛分级，见“实验动物镇静、止痛和麻醉”。

3.2.2动物状态：

动物状态的五个方面的评价，体重、外貌、可衡量的临床体征，无端外界刺激的行为和反应。严重的临床症状，不限于这五个方面。

动物的体貌分级如下：

1级：瘦弱-骨骼结构极为突出，很少或没有肉/肌肉块，腰椎明显分割

2级：偏瘦-分割脊椎动物柱明显，背骨盆骨头容易摸到，肌肉质量减少

3级：适中-轻微压力可见脊椎和背骨盆不突出

4级：偏胖-脊柱是一个连续的柱，重压下可触及脊椎

5级：肥胖，轮廓光滑笨重，骨骼结构消失在肉和皮下脂肪

不过对于某些实验来说，体重不是一个很好的指标，可以使用肌肉萎缩或消瘦作为评价指标，比如肿瘤实验，因为有瘤重的因素，体重估算会不太准确。1级须立即安乐死，2级需要支持性改善营养。5级须考虑低脂低蛋白饲料。

动物出现实验预期以外的疼痛或痛苦，应评估对动物福利和实验结果的影响，如果实验预期以外的疼痛或痛苦不影响实验结果，必须给病痛动物提供标准的兽医治疗。如果实验预期以外的疼痛或痛苦影响实验结果，或提供标准的兽医治疗会影响实验结果，动物应实施安乐死。

毒理学研究与癌症研究中，作为一个实验程序，动物被允许死亡或垂死，但在发现任何动物垂死，恶病质，或不能自主获得食物和水等严重情况（疼痛或痛苦等级量化表的3级评分项目），须安乐死（除非有实验目的要在动物濒死到死亡这个时间段内要获得某些信息，）

病情恶化的动物，应移到单个笼具，使之不受其他动物伤害。

可以依据疼痛或痛苦等级量化表，对建立动物的人道终点作出适当的建议及解释。

表3 疼痛或痛苦等级量化表

表4 几种动物疼痛/痛苦时的异常行为表现

3.3 特定指标，一般指特殊观察研究所衡量的指标，如肿瘤研究、组织系统为观察对象的研究等。具体的实验项目，人道主义终点标准如下：

3.3.1肿瘤研究：

3.3.2毒理学研究

如果实验可能会导致损伤或濒死，至少每天由有经验的人观察并识别以下的疾病、受伤或异常行为：

表5 毒理学研究的观察指标

当动物出现疾病的征兆时。对动物的状况进行评估尽快建立干预计划。

3.3.3 基因修饰动物研究的推荐指标

经过基因修饰操作后,动物出现异常、不可知的健康状况的可能性增加,如抵抗力降低、易发肿瘤或生理功能紊乱等。考虑人道终点时,可结合基因修饰动物的基因型可能出现的异常,选择相应的观察指标。

（国标中关于感染类疾病动物实验的人道终点内容未列入，因为我的单位没有二类生物安全级别以上的动物室。）