植物分子学基础知识

1.基因组：DNA分子所携带的遗传信息总和。 2核基因组：基因组大部分被限制在细胞核内，受核膜的保护，而与细胞质相隔离，这部分被局限在核内的基因组。 3. C值：代表每一个生物种属的单倍体基因组的DNA含量，一个生物物种C值是恒定的。由C值大小可看出，随着生物的进化，生物体的结构和功能越复杂，其C值就越大。 4.基因家族：基因组中许多来源相同、结构相似、功能相关的一套基因。 5.基因簇：基因家族成员在基因组中有时彼此靠近并成串地排列在一起，组成基因簇。 6.假基因：核苷酸序列与相应正常功能基因基本相同，但却不能合成功能蛋白质的失活基因。 7.断裂基因：单个基因中存在两种成分，即有编码意义的DNA片段，称为外显子，无编码意义的DNA片段，称为内含子，编码的外显子为不编码的插入序列内含子所中断，把具有这类结构的基因称为断裂基因。 8.叶绿体基因的组成？ ⑴与执行基因表达功能相关的基因 :①核糖体RNA基因 ②tRNA基因 ③核糖体蛋白基因 ④RNA聚合酶基因 ⑵光合作用有关基因 :①Rubisco大亚基基因 ②光系统Ⅱ基因 ③细胞色素b-f复合物基因④光系统Ⅰ基因 ⑤ATP合酶基因 ⑥ndh基因 9.操纵子：是存在于原核生物中的基因表达协调单位。 10.启动子： 原核生物保守的启动子序列是在起始点上游-35bp处有TTGACA序列和-10bp处有TATAAT序列序列，两个序列之间隔有一个17bp的区域，这两个序列分别是RNA聚合酶的识别信号和结合位点。 11.内含子：存在于真核生物基因中无编码意义而被切除的序列。 12.线粒体基因组的组成？ 编码线粒体自身的rRNA、tRNA,、蛋白质， 编码5S rRNA， 编码核糖体蛋白以及编码呼吸链复合体亚基的基因。 13.线粒体基因的一些特征？ ①线粒体的遗传密码与核基因的标准密码在某些密码上有所不同。 ②在不同植物线粒体基因组中，内含子的数目是不等的。 ③在植物线粒体基因组中，某些功能相关基因往往成簇排列在一起。 14.DNA重组技术：用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。包括对DNA分子的精细切割、部分序列的去除、新序列的加入和连接、DNA分子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等，是基因工程技术的核心。 DNA重组技术包括：分离DNA；使其与载体相连接，即重组DNA；再把重组的DNA引入受体细胞，使其复制、增殖；从许许多多繁殖后的受体细胞中筛选出含有重组DNA分子的克隆；最后研究该克隆DNA分子的表达过程。 核酸分子操作常用的酶：限制性内切酶、聚合酶、磷酸化酶和激酶、连接酶、核酸酶。 15.限制性内切酶对双链DNA进行切割产生3种类型切口： ①形成平头末端，断裂位置处在对称结构的中心（TC|GA）。②形成5’粘性末端，即5’单链延伸末端(G|AATTC) ③形成3’粘性末端(CTG|CAG) 15.DNA聚合酶特性？ ①只能催化脱氧核糖核苷酸加到已有核酸链的游离3’-OH上，并使链从5’向3’方向延长，但它不能使dNTP自身发生聚合，即它需要引物链和模板链的存在。 ②许多DNA聚合酶具有从3’～5’的外切酶活性。 16.碱性磷酸酶作用：催化核酸的5’末端脱去磷酸基团。 有两种碱性磷酸酶：来自大肠杆菌的细菌碱性磷酸酶和小牛肠碱性磷酸酶。 17.连接酶：分子克隆中用于将两段DNA拼接起来的酶。 T4DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶除了均能催化上述连接反应外，还能封闭双链DNA分子上相邻核苷酸之间的切口，但不能连接少了一个或数个核苷酸的缺口。 T4DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶是常用的连接酶。 区别：T4DNA连接酶是唯一在正常条件下能催化两个具平末端的双链DNA片段之间连接反应的连接酶，而大肠杆菌DNA连接酶不具备连接平末端的活性，故T4DNA连接酶应用更为广泛。 18.DNA分子修饰（策略）及连接酶连接？（简答题） ⑴使DNA分子末端形成平末端 ①用内切酶切成平末端 ②从粘末端改造成平末端的补齐法③从粘末端改造平末端的削平法。 ⑵使DNA分子形成粘性末端 ①添加连接子 ②用适当的限制性内切酶把载体DNA或外源DNA酶切成粘性末端 ③添加适配器。 19.核酸酶分为核酸内切酶和外切酶？ ①S1核酸酶：S1核酸酶是高度特异的单链内切酶，它催化单链DNA或RNA分子降解为5’-单核苷酸，也能作用于双链DNA分子的单链区。 ②Bal31核酸酶：此酶是单链专一的3’外切酶，同时具有单链内切酶活性，它降解双链DNA的缺口或DNA超螺旋上产生的瞬时单链区域。 ③脱氧核糖核苷酸Ⅰ：DNaseⅠ是降解双链DNA产生3’-OH末端寡核苷酸的内切酶。 ④外切酶Ⅲ：exoⅢ是多功能的酶，主要功能是双链3’-5’外切酶，从3’-羟基末端释放出5’-核苷酸。 20.分子杂交分为 DNA-DNA,DNA-RNA,蛋白质-蛋白质三种杂交。 21.克隆：①经无性繁殖由共同祖先形成的一群相同的DNA分子、细胞或个体组成的群体。（作名词时）②欲形成一个DNA分子、细胞或个体的无性繁殖系所要经历的过程。（作动词时）③如何通过细胞，主要是大肠杆菌细胞来克隆产生某一基因或DNA片段的大量拷贝的过程。 22.大肠杆菌的遗传标记一般采用三字命名规则。 23.最低培养基：只含碳源和盐的培养基。 富集培养基：当培养基中再加入氨基酸、核苷酸前体、维生素和其他大肠杆菌自身不能合成的化合物时，则组成富集培养基。 大肠杆菌可以在最低培养基和富集培养基上培养。 大肠杆菌特点：属肠细菌科，革兰氏染色阴性，菌体杆状，是需氧或兼性厌氧菌，不形成芽孢和荚膜。 24.质粒：细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自主进行复制的遗传单位。 质粒是一些双链环形的DNA分子，其大小范围从1kb至200kb不等。质粒DNA环形分子具有三种不同的构型：①共价闭合环形（CCC），它具有超螺旋性质，扭曲使分子处于紧张状态。②开环（OC），双链中有一条链发生断裂，并且常不限于一处。③线性DNA，它为酶切割后双链断裂形成的。 质粒DNA在细菌中的复制有两种类型：松弛型控制复制和严紧型控制复制。 二者联系：①严紧型控制复制与细菌的繁殖密切相关，它的复制取决于在细菌细胞周期之处合成的不稳定蛋白，因此与细菌染色体的复制相同步。这种复制形成每个细胞内拷贝数较少，如只有1～3个质粒；②当在细菌培养基中加入氯霉素而抑制细菌蛋白质合成时，随着细菌染色体复制停止，严紧型质粒的复制同步停止。由于严紧型质粒的拷贝数较少，故不适于在基因克隆中使用，相反，松弛型质粒拷贝数较高。因此基因工程中使用的质粒均属这种类型，这样当加入氯霉素蛋白质合成和细菌染色体复制被阻断时，松弛型质粒继续复制，并达到每个细胞1000～3000个质粒的水平，这样每个细胞中50%以上的DNA是质粒DNA，质粒拷贝数大大超过大肠杆菌个数这个过程称质粒DNA扩增。 25.外源DNA与载体重组的几种情况？ ①平端的连接：采用T4噬菌体DNA连接酶，平端连接相对于粘端连接是低效反应，它要求4个条件：低浓度的ATP，高浓度的连接酶，高浓度的平端，没有亚精胺类的多胺。加入适量的聚乙二醇能促进平端的连接，为了防止线性载体自身环化，故连接前线粒载体DNA需要进行5’端脱磷酸处理， ②带有相同粘末端的连接：为防止自身环化，在连接前对线性DNA载体进行5’端去磷酸处理，插入片段之间的4个末端均为粘性互补序列，所以插入序列，所以插入序列有两种可能与载体连接，即正方向与反方向，必须注意筛选正向连接的重组体。 ③不同粘末端之间的连接：除了加适配子和连接子方法外，还有两种方法使其连接。 一是定向克隆，用两种不同的限制性内切酶消化需要进行重组的载体和外源DNA分子，从而使DNA分子两端不同的粘性末端，由于载体和外源DNA是用同一对限制酶切割的，故分子两端以相应的粘性末端连接起来，使外源DNA只能以一个方向插入到载体中。 二是当两个不能互补的粘性末端重组时，可采用把粘性末端填平或去除粘性平端成平末端等方法来连接，并形成新的内切酶识别位点。 26.重组DNA导入受体细胞？ ①大肠杆菌感受态细胞转化法（CaCl2法）②高压电穿孔法。 27.阳性重组体的筛选和鉴定？ ①抗生素平板筛选：在重组DNA分子转化感受态细胞后，把这些细胞置于含有某种抗生素的培养基平板上生长。克隆载体往往带有抗生素抗性基因，如果在重组时外源基因没有插入抗性基因中，则此克隆载体的抗生素抗性基因使受体细胞能在平板上生长，这些在平板上能存在活下来的菌落则为阳性重组子的菌落，反之，未转化的宿主细胞则不能存活。 ②β半乳糖苷酶系统筛选：当由质粒构建的重组体转化成宿主细胞后，在平板上，β半乳核苷酶可使其生成蓝色菌落，但当外源DNA片段插入到载体的多克隆位点后，造成插入失活， β半乳糖苷酶失活，从而使带重组载体的菌落呈无色菌落。 ③小量制备载体DNA作限制酶切分析：取上述筛选的阳性菌落，做小量制备并从中分离出重组质粒或噬菌体DNA用相应内切酶进行消化，并进行凝胶电泳把不同片段进行大小分离，此时可根据凝胶上是否存在与载体或插入片段大小相同的DNA片段来推断是否含有目的DNA片段，以确定此菌落是否为真阳性克隆。 ④Southern印迹杂交分析和免疫化学检测分析：可采用两种方式：一是把限制酶切分析的凝胶转移到如硝酸纤维素薄膜等支持物上、用相应目的基因片段的探针进行杂交分析； 另一种是将转化菌落从平板上直接转移到硝酸纤维素薄膜上，用相应目的基因片段作探针进行原位菌落杂交鉴定阳性克隆。此外，当进行原位菌落杂交时，如果插入片段能够表达出蛋白的话，可用所检测DNA编码抗原的相应抗体，作免疫化学检测分析，以鉴定阳性克隆。 28.PCR聚合酶链反应： 特点：简易性，高效性，快捷性，灵活性并且易于操作。 29.引物设计？（简答） ①引物长度：作为PCR引物的寡核苷酸长度一般为15～30-nt。引物对模板的特异性随着引物长度增加而增加，但引物也不能过长，否则使引物与模板DNA杂交速率下降，影响PCR效率。②碱基组成：尽量避免聚嘌呤或聚嘧啶状态的出现，尤其在链的3’末端不应超过3个连续的G或3个连续的C引物中G+C含量一般为40%～60%。 ③对引物3’端和5’端的要求：3’端不能进行修饰，尤其是3’端的第一位不能发生错配，引物的5’端限定了PCR产物的长度，只要引物与模板DNA结合的长度足够，其5’末端碱基可以不与模板DNA结合呈游离状态，或者对5’端进行修饰。 ④简并引物：由多种推知的寡核苷酸组成的，彼此之间仅有一个或数个核苷酸差异的混合物称为简并引物。 30.由基因PCR拓展的相关技术：嵌套PCR，反向PCR，锚式PCR，定量PCR，不对称PCR。（其中各自的定义要了解） 31.一种理想的质粒载体应具备下述条件？ ①分子相对大小，3～10kb左右，这可能限制性内切酶在质粒上的作用点减少，拷贝数要求多，这可导致克隆的外源基因量得到增加，一般采用松弛型复制子的质粒。 ②在复制子的外适当的位点，构建几个限制性内切酶的单一切点，而且酶切位点最好位于易于检测的表型基因上。 ③赋予宿主细胞易于检测的表型。 32.入口噬菌体基因分3个组成部分：左臂，右臂，及中央区。若用外源DNA取代中央区的基因，不会影响噬菌体的形成，这一特性是入噬菌体DNA作为载体的基础。