罗氏推出第一款蛋白亲和纯化树脂：cOmplete His-Tag Purification Resin
cOmplete His-Tag Purification Resin
灵活纯化蛋白、保证效能
选择靶蛋白适宜的缓冲条件
cOmplete His-Tag Purification Resin是一种新型的高效能IMAC基质，用于裂解液中His标签蛋白的一步法纯化，操作方便。采用罗氏特殊的镍螯合化学技术，该纯化树脂与常用的还原剂（如DTT ）、金属蛋白酶螯合抑制剂（如E DTA）兼容，适用于广泛底物及盐浓度的缓冲条件。基于这种很强的组分兼容性，您可灵活地优化缓冲条件，以保持蛋白质的高度稳定性及溶解度，保护蛋白不被蛋白酶降解及避免被氧化。
使用DTT 与EDTA稳定您的蛋白。
灵活使用含E DTA或DTT 的缓冲液，在不降低纯化效能的情况下，保持蛋白的高度稳定性。
获得大量高纯度蛋白质。
树脂的高结合效能与结合特异性是一步法纯化蛋白的必备条件。
毒性废物排出显著降低。
镍脱落量极少，大大减少了毒性废物量，并避免了镍离子重新螯合填料的麻烦。
减少镍脱落
与氨基三乙酸（NTA ）树脂或亚氨基二乙酸（IDA ）螯合树脂不同，cOmplete His-Tag Purification Resin 是通过一种特殊的化学技术，使用一种强效螯合剂将镍离子固定化获得的。
即使在E DTA与DTT 存在的条件下，镍离子的脱落量也极少，避免重新螯合填料的需要（图1）。
图1：严苛条件下，不同树脂的Ni 离子脱落情况。
cOmplete His-Tag Purification Resin 与另两种不同螯合剂树脂在9倍体积的含10 mM EDTA 、10 mM DTT、500 mM 咪唑、300 mM NaCl与50 mM NaH2PO4的缓冲液中（pH8.0），室温孵育1 小时。通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS ），对释放至缓冲液中的镍离子量进行测定。
结果：孵育期间，cOmplete His-Tag Purification Resin镍离子脱落率小于1%。而采用不同螯合剂的两种树脂，镍离子释放至缓冲液中的量分别高达76% 与59% 。
避免频繁的柱再生操作
随心所欲地进行靶蛋白合适的缓冲条件的选择，无需担心会降低树脂的稳定性。使用含还原剂（如DTT ）与/ 或金属蛋白酶抑制剂（如E DTA）的缓冲液，不会改变cOmplete His-Tag Purification Resin的效能（图2 ）。得益于新型螯合剂的作用，镍离子与树脂紧密结合（图2 ）。
图2：无Ni 重新螯合的情况下，经多次使用后的树脂效能。在cOmplete His-Tag Purification Resin (0.5 ml)中装载含7ml His6-CFP （青色荧光蛋白）的裂解液。裂解缓冲液含有 10mM EDTA 与10mM DTT 。使用5ml 缓冲液A （50mM NaH2PO4 pH 8.0/RT 、300mM NaCl 、10mM EDTA、10mM DTT ）洗涤树脂。洗涤步骤后，使用1.5ml缓冲液B （缓冲液A+250 mM 咪唑）进行结合蛋白的洗脱，并对蛋白峰进行定量测定。在下一次纯化操作前，使用15ml缓冲液A进行树脂洗涤。对5次连续纯化操作后的 mAU 进行计算 （相当于柱纯化获得的总蛋白），绘制柱状图。
结果：即使在严苛的缓冲条件下，5 次蛋白纯化操作中，cOmplete His-Tag Purification Resin 依然可保持其稳定性，无需进行镍离子的更新螯合。
使用高效能树脂，获得高性价比
纯化柱对蛋白的结合效能主要取决于靶蛋白特性：如靶蛋白分子量、Stokes 半径、结合条件与添加组分。cOmplete His-Tag Purifcation Resin的设计是对经济性及高纯化性能的极佳平衡。在树脂中装载过量蛋白会导致蛋白质不稳定。cOmplete His-Tag Purification Resin对小分子蛋白的结合量最大。蛋白质分子越大，处理载量随之降低（表1）。
表1：树脂对各种蛋白的结合能力。
和其他任何树脂一样，cOmplete His-Tag Purification Resin 对蛋白的结合效能呈现时间依赖性。延长孵育时间可获得更高效能（图3）。
图3 ：树脂结合蛋白的时间相关性。使用缓冲液A 进行250µl cOmplete His-Tag Purification Resin平衡处理，使用同等含量的His6-tagged T4 Gene 32蛋白溶液分别孵育10、20、30、45与60分钟。离心获得上清液，测定其中的蛋白质浓度。根据添加的蛋白量与上清中的蛋白量之间的差值进行已结合蛋白计算。
获得高度纯化蛋白
cOmplete His-Tag Purification Resin是一种基于Sepharose琼脂糖、预带电荷的、即用型N i2+- 螯合基质，用于His标签蛋白的实验室分析及大规模纯化。通过粗裂解液的一步纯化处理，即可获得高纯度目标蛋白。仅单次纯化操作即可获得理想的蛋白纯度（图4）。
图4：His6-与His10-标签蛋白的有效纯化。2µl天然裂解液含有中等含量的His6-MBP（A）或His10-T4 DNA 连接酶（B），将裂解液与缓冲液A，及50或40µl cOmplete His-Tag Purification Resin共孵育2小时，缓冲液A成分为：150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH 7.5 、2mM DTT 、5或10mM 咪唑。使用同样的缓冲液洗涤掉未结合组分，并使用附加400mM咪唑的缓冲液A进行蛋白洗脱。
结果：仅一次纯化操作，cOmplete His-Tag Purification Resin即可生成高度纯化的靶蛋白。
避免进行毒性镍溶液处理
Ni2+ 具有生物毒性，并且是一种已知致癌剂。镍对带有氧、氮与硫供体的配基具有高度亲和性，因此会影响酶及DNA的功能。镍的化学结构类似于锌，锌是多种酶的辅基，当镍占据锌结合位点时，酶功能将受到很高程度的影响。镍过量还可导致肺癌、鼻癌及骨肉瘤的发生。在cOmplete His-Tag Purification Resin 中，由于其使用的Ni 螯合剂的独特化学特性，树脂上结合的金属离子得到保护，防止还原剂的结合。因此，该纯化柱的镍脱落率降至极低，也不需要进行频繁的再生循环（包括使用镍溶液进行重新螯合），可显著降低毒性镍溶液处理的风险，降低有毒废液的处理成本与环境危害。
原文链接：http://www.bioku.net/archives/3243
灵活纯化蛋白、保证效能
选择靶蛋白适宜的缓冲条件
cOmplete His-Tag Purification Resin是一种新型的高效能IMAC基质，用于裂解液中His标签蛋白的一步法纯化，操作方便。采用罗氏特殊的镍螯合化学技术，该纯化树脂与常用的还原剂（如DTT ）、金属蛋白酶螯合抑制剂（如E DTA）兼容，适用于广泛底物及盐浓度的缓冲条件。基于这种很强的组分兼容性，您可灵活地优化缓冲条件，以保持蛋白质的高度稳定性及溶解度，保护蛋白不被蛋白酶降解及避免被氧化。
使用DTT 与EDTA稳定您的蛋白。
灵活使用含E DTA或DTT 的缓冲液，在不降低纯化效能的情况下，保持蛋白的高度稳定性。
获得大量高纯度蛋白质。
树脂的高结合效能与结合特异性是一步法纯化蛋白的必备条件。
毒性废物排出显著降低。
镍脱落量极少，大大减少了毒性废物量，并避免了镍离子重新螯合填料的麻烦。
减少镍脱落
与氨基三乙酸（NTA ）树脂或亚氨基二乙酸（IDA ）螯合树脂不同，cOmplete His-Tag Purification Resin 是通过一种特殊的化学技术，使用一种强效螯合剂将镍离子固定化获得的。
即使在E DTA与DTT 存在的条件下，镍离子的脱落量也极少，避免重新螯合填料的需要（图1）。
图1：严苛条件下，不同树脂的Ni 离子脱落情况。
cOmplete His-Tag Purification Resin 与另两种不同螯合剂树脂在9倍体积的含10 mM EDTA 、10 mM DTT、500 mM 咪唑、300 mM NaCl与50 mM NaH2PO4的缓冲液中（pH8.0），室温孵育1 小时。通过电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS ），对释放至缓冲液中的镍离子量进行测定。
结果：孵育期间，cOmplete His-Tag Purification Resin镍离子脱落率小于1%。而采用不同螯合剂的两种树脂，镍离子释放至缓冲液中的量分别高达76% 与59% 。
避免频繁的柱再生操作
随心所欲地进行靶蛋白合适的缓冲条件的选择，无需担心会降低树脂的稳定性。使用含还原剂（如DTT ）与/ 或金属蛋白酶抑制剂（如E DTA）的缓冲液，不会改变cOmplete His-Tag Purification Resin的效能（图2 ）。得益于新型螯合剂的作用，镍离子与树脂紧密结合（图2 ）。
图2：无Ni 重新螯合的情况下，经多次使用后的树脂效能。在cOmplete His-Tag Purification Resin (0.5 ml)中装载含7ml His6-CFP （青色荧光蛋白）的裂解液。裂解缓冲液含有 10mM EDTA 与10mM DTT 。使用5ml 缓冲液A （50mM NaH2PO4 pH 8.0/RT 、300mM NaCl 、10mM EDTA、10mM DTT ）洗涤树脂。洗涤步骤后，使用1.5ml缓冲液B （缓冲液A+250 mM 咪唑）进行结合蛋白的洗脱，并对蛋白峰进行定量测定。在下一次纯化操作前，使用15ml缓冲液A进行树脂洗涤。对5次连续纯化操作后的 mAU 进行计算 （相当于柱纯化获得的总蛋白），绘制柱状图。
结果：即使在严苛的缓冲条件下，5 次蛋白纯化操作中，cOmplete His-Tag Purification Resin 依然可保持其稳定性，无需进行镍离子的更新螯合。
使用高效能树脂，获得高性价比
纯化柱对蛋白的结合效能主要取决于靶蛋白特性：如靶蛋白分子量、Stokes 半径、结合条件与添加组分。cOmplete His-Tag Purifcation Resin的设计是对经济性及高纯化性能的极佳平衡。在树脂中装载过量蛋白会导致蛋白质不稳定。cOmplete His-Tag Purification Resin对小分子蛋白的结合量最大。蛋白质分子越大，处理载量随之降低（表1）。
表1：树脂对各种蛋白的结合能力。
和其他任何树脂一样，cOmplete His-Tag Purification Resin 对蛋白的结合效能呈现时间依赖性。延长孵育时间可获得更高效能（图3）。
图3 ：树脂结合蛋白的时间相关性。使用缓冲液A 进行250µl cOmplete His-Tag Purification Resin平衡处理，使用同等含量的His6-tagged T4 Gene 32蛋白溶液分别孵育10、20、30、45与60分钟。离心获得上清液，测定其中的蛋白质浓度。根据添加的蛋白量与上清中的蛋白量之间的差值进行已结合蛋白计算。
获得高度纯化蛋白
cOmplete His-Tag Purification Resin是一种基于Sepharose琼脂糖、预带电荷的、即用型N i2+- 螯合基质，用于His标签蛋白的实验室分析及大规模纯化。通过粗裂解液的一步纯化处理，即可获得高纯度目标蛋白。仅单次纯化操作即可获得理想的蛋白纯度（图4）。
图4：His6-与His10-标签蛋白的有效纯化。2µl天然裂解液含有中等含量的His6-MBP（A）或His10-T4 DNA 连接酶（B），将裂解液与缓冲液A，及50或40µl cOmplete His-Tag Purification Resin共孵育2小时，缓冲液A成分为：150mM NaCl、50mM Tris-HCl pH 7.5 、2mM DTT 、5或10mM 咪唑。使用同样的缓冲液洗涤掉未结合组分，并使用附加400mM咪唑的缓冲液A进行蛋白洗脱。
结果：仅一次纯化操作，cOmplete His-Tag Purification Resin即可生成高度纯化的靶蛋白。
避免进行毒性镍溶液处理
Ni2+ 具有生物毒性，并且是一种已知致癌剂。镍对带有氧、氮与硫供体的配基具有高度亲和性，因此会影响酶及DNA的功能。镍的化学结构类似于锌，锌是多种酶的辅基，当镍占据锌结合位点时，酶功能将受到很高程度的影响。镍过量还可导致肺癌、鼻癌及骨肉瘤的发生。在cOmplete His-Tag Purification Resin 中，由于其使用的Ni 螯合剂的独特化学特性，树脂上结合的金属离子得到保护，防止还原剂的结合。因此，该纯化柱的镍脱落率降至极低，也不需要进行频繁的再生循环（包括使用镍溶液进行重新螯合），可显著降低毒性镍溶液处理的风险，降低有毒废液的处理成本与环境危害。
原文链接：http://www.bioku.net/archives/3243
