猪宰后肌肉体系中 μ-calpain 及肌原纤维蛋白理化特性的变化规律
魏秀丽，谢小雷，张春晖，李 侠，王春青
（中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193）
摘要
【目的】研究猪宰后 1—168 h，肌肉体系中 μ-calpain 及肌原纤维蛋白理化特性变化规律，并探究肌肉持水性变化机理，为冷鲜肉汁液流失控制提供理论依据。【方法】取宰后 1 h 内的猪背最长肌，在 4℃条件下分别成熟 6、12、24、72、120 和 168 h，通过活性电泳（casein zymography）对 μ-calpain 活性定量分析，对肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）进行过程测定，利用 SDS-PAGE 变性凝胶电泳分析肌原纤维蛋白降解聚合情况，研究宰后肌肉的成熟与肌原纤维蛋白的结构变化规律；通过测定肌原纤维蛋白表面疏水性和溶解性，考察肌原纤维蛋白水合力的变化，利用加压滤纸法测定肌肉的持水性（water-holding capacity，WHC），并借助低场核磁共振技术（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）定性定量考察肌肉 3 种不同状态水（结合水、不易流动水及自由水）的分布和迁移。【结果】宰后 1—24 h，μ-calpain 活性升高，肌原纤维蛋白未发生明显降解，MFI 无显著变化（ P ＞0.05）。宰后 24 h 肌肉进入成熟期，μ-calpain 活性逐渐下降，MFI值显著升高（ P ＜0.05），肌原纤维蛋白显著降解，肌肉持水性随之改变。肌肉成熟过程中，μ-calpain 作用于肌肉蛋白导致蛋白质结构伸展并降解，一方面会有低分子量的蛋白生成，增加蛋白质的比表面积，使其溶解度增加；另一方面也有疏水残基的暴露及蛋白的交联聚合，导致蛋白溶解度降低，表面疏水性增加，这两者之间的竞争结果决定了降解后蛋白质的水合特性。其中，宰后 24—120 h，μ-calpain 适度降解肌原纤维蛋白，溶解度显著升高（ P ＜0.05），使肌肉中不易流动水 P 22 升高（ r =0.286， P ＜0.01），自由水 P 23 下降（ r =-0.246， P ＜0.05）；肌原纤维蛋白内部疏水性残基的暴露引起表面疏水性显著升高（ P ＜0.05），致使肌肉自由水 P 23 升高( r =0.319， P ＜0.01)；LF-NMR-T 2 结果表明结合水 P 21 与不易流动水 P 22 的相关系数为 r =-0.890（ P ＜0.01），不易流动水 P 22 与自由水 P 23 的相关系数为 r =-0.360（ P ＜0.01），表明结合水和自由水会“态变”为不易流动水，蛋白结合水随着蛋白质的高级结构被破坏，结合水被释放，转变为不易流动水，同时肌肉蛋白的降解导致位于肌纤维细胞外的自由水流回肌纤维细胞内部，肌肉持水性升高。宰后 120—168 h，肌原纤维蛋白的高度降解，引发低分子量蛋白相互聚集，表面疏水性和溶解度下降，肌肉中不易流动水 P 22 降低（ P ＜0.05），自由水 P 23 升高（ P ＜0.05），不易流动水“态变”成自由水，肌原纤维结构内的不易流动水逐渐流向肌原纤维外的空隙，变为自由水，从而造成新的汁液流失，肌肉持水性下降。【结论】宰后 24—120 h，μ-calpain 介导的肌原纤维蛋白降解，使蛋白溶解度和表面疏水性增加，水合力上升，肌肉中结合水和自由水“态变”为不易流动水，肌肉持水性升高。宰后 120—168 h，肌原纤维蛋白进一步降解，低分子量蛋白发生交联聚合，蛋白水合力降低，肌肉中不易流动水“态变”成自由水成为汁液流失。
关键词
猪；宰后成熟；μ-钙激活酶；肌原纤维蛋白；水合特性；持水性；水分迁移
引言
【研究意义】畜禽宰后严重的汁液流失，不仅会直接影响肉及肉制品的外观、嫩度和风味，还会降低肉的营养价值，造成严重的经济损失 [1] 。因此，开展肌肉保水性影响机制的基础理论研究，探索改善肌肉保水性的有效措施，不仅对探讨冷鲜肉汁液流失具有重要的理论意义，对肉制品加工也具有指导作用。【前人研究进展】肌肉中水分含量约为 75%，以结合水、
不易流动水和自由水 3 种状态存在 [2] 。肉的保水能力是肉的重要品质指标，通常用持水性（water-holding capacity，WHC）衡量。大量研究表明，畜禽屠宰后肌糖原无氧酵解、肌肉僵直收缩及蛋白氧化等因素均会影响肌肉的持水性。畜禽宰后肌糖原的无氧酵解，生成的乳酸会导致 pH 降低，当接近肌球蛋白等电点（pI 约为 5.4）时，肌肉蛋白的持水能力下降 [3] ；宰后肌细胞中 ATP 被消耗，粗丝与细丝之间形成横桥，导致肌肉僵直，肌丝空间减小，肌纤维中的水分被挤出至外部空间，造成水分流失 [4] ；蛋白氧化也能显著改变蛋白质的电荷效应和空间效应，从而影响肌肉的持水性 [5] 。Huff-Lonergan 等 [6] 研究发现，宰后肌肉的蛋白质降解也可能伴随着汁液流失；Lawson [7] 进一步研究发现，宰后肌动骨架蛋白和细胞膜之间的连接蛋白（intergrin）降解，形成汁液流失通道。但 Kristensen等 [8] 认为骨架蛋白质的降解会增强肌肉的持水性，Schäfer 等 [9] 研究得出肌肉骨架蛋白的降解与汁液流失无关。因此，关于肌肉蛋白降解与持水性之间的关系尚不明确。僵直后期，肌细胞的能荷降低，ATP 的缺乏，肌浆网中释放的 Ca 2+ 不能被重新吸收而大量积累，活化了对肌肉蛋白降解起到重要作用的钙激活酶（μ-calpain） [10] 。μ-calpain 能够降解肌肉蛋白，并使Z 盘崩解 [11] ，近年来关于 μ-calpain 对肌原纤维蛋白的降解多集中在肉的嫩化研究方面。【本研究切入点】国内外已有相关研究表明，肌肉蛋白结构的变化会导致蛋白-水相互作用改变，引起水分分布变化与迁移，进而改变肌肉的持水性。李银等 [12] 研究发现肌原纤维蛋白氧化引起的结构变化，蛋白水合能力下降，不易流动水“态变”为自由水；Christensen [13] 等研究发现肌原纤维蛋白的热变性使蛋白-水相互作用改变，蒸煮损失增加。但宰后 μ-calpain 介导的肌肉蛋白结构改变与持水性变化的内在联系，目前还鲜见报道。【拟解决的关键问题】以猪背最长肌（M. longissimus dorsi）为原料，通过分析宰后肌肉 μ-calpain 活性、肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）、肌原纤维蛋白的降解聚合、表面疏水性和溶解度等指标的变化，并借助低场核磁共振技术（low field nuclearmagnetic resonance，LF-NMR）分析宰后成熟过程中肌肉中水分的分布及迁移，阐释宰后肌肉蛋白理化特性变化规律及水分迁移机制，为冷鲜肉汁液流失控制提供依据。
结论
猪宰后肌肉体系中μ-calpain与肌原纤维蛋白理化特性均呈动态变化，肌肉中不同状态水间发生相互迁移，引起肌肉持水性变化。宰后 24—120 h，μ-calpain对肌原纤维蛋白的适度降解导致蛋白水合力升高，自由水“态变”为不易流动水，肌肉持水性升高；宰后120—168 h，肌原纤维蛋白的持续降解，导致蛋白溶解度降低，疏水性增大，蛋白的水合能力下降，不易流动水又持续“态变”为自由水，肌肉的持水性降低。不易流动水与自由水也可以发生相互“态变”，引起肌肉中水分分布变化与迁移。
（中国农业科学院农产品加工研究所/农业部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193）
摘要
【目的】研究猪宰后 1—168 h，肌肉体系中 μ-calpain 及肌原纤维蛋白理化特性变化规律，并探究肌肉持水性变化机理，为冷鲜肉汁液流失控制提供理论依据。【方法】取宰后 1 h 内的猪背最长肌，在 4℃条件下分别成熟 6、12、24、72、120 和 168 h，通过活性电泳（casein zymography）对 μ-calpain 活性定量分析，对肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）进行过程测定，利用 SDS-PAGE 变性凝胶电泳分析肌原纤维蛋白降解聚合情况，研究宰后肌肉的成熟与肌原纤维蛋白的结构变化规律；通过测定肌原纤维蛋白表面疏水性和溶解性，考察肌原纤维蛋白水合力的变化，利用加压滤纸法测定肌肉的持水性（water-holding capacity，WHC），并借助低场核磁共振技术（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）定性定量考察肌肉 3 种不同状态水（结合水、不易流动水及自由水）的分布和迁移。【结果】宰后 1—24 h，μ-calpain 活性升高，肌原纤维蛋白未发生明显降解，MFI 无显著变化（ P ＞0.05）。宰后 24 h 肌肉进入成熟期，μ-calpain 活性逐渐下降，MFI值显著升高（ P ＜0.05），肌原纤维蛋白显著降解，肌肉持水性随之改变。肌肉成熟过程中，μ-calpain 作用于肌肉蛋白导致蛋白质结构伸展并降解，一方面会有低分子量的蛋白生成，增加蛋白质的比表面积，使其溶解度增加；另一方面也有疏水残基的暴露及蛋白的交联聚合，导致蛋白溶解度降低，表面疏水性增加，这两者之间的竞争结果决定了降解后蛋白质的水合特性。其中，宰后 24—120 h，μ-calpain 适度降解肌原纤维蛋白，溶解度显著升高（ P ＜0.05），使肌肉中不易流动水 P 22 升高（ r =0.286， P ＜0.01），自由水 P 23 下降（ r =-0.246， P ＜0.05）；肌原纤维蛋白内部疏水性残基的暴露引起表面疏水性显著升高（ P ＜0.05），致使肌肉自由水 P 23 升高( r =0.319， P ＜0.01)；LF-NMR-T 2 结果表明结合水 P 21 与不易流动水 P 22 的相关系数为 r =-0.890（ P ＜0.01），不易流动水 P 22 与自由水 P 23 的相关系数为 r =-0.360（ P ＜0.01），表明结合水和自由水会“态变”为不易流动水，蛋白结合水随着蛋白质的高级结构被破坏，结合水被释放，转变为不易流动水，同时肌肉蛋白的降解导致位于肌纤维细胞外的自由水流回肌纤维细胞内部，肌肉持水性升高。宰后 120—168 h，肌原纤维蛋白的高度降解，引发低分子量蛋白相互聚集，表面疏水性和溶解度下降，肌肉中不易流动水 P 22 降低（ P ＜0.05），自由水 P 23 升高（ P ＜0.05），不易流动水“态变”成自由水，肌原纤维结构内的不易流动水逐渐流向肌原纤维外的空隙，变为自由水，从而造成新的汁液流失，肌肉持水性下降。【结论】宰后 24—120 h，μ-calpain 介导的肌原纤维蛋白降解，使蛋白溶解度和表面疏水性增加，水合力上升，肌肉中结合水和自由水“态变”为不易流动水，肌肉持水性升高。宰后 120—168 h，肌原纤维蛋白进一步降解，低分子量蛋白发生交联聚合，蛋白水合力降低，肌肉中不易流动水“态变”成自由水成为汁液流失。
关键词
猪；宰后成熟；μ-钙激活酶；肌原纤维蛋白；水合特性；持水性；水分迁移
引言
【研究意义】畜禽宰后严重的汁液流失，不仅会直接影响肉及肉制品的外观、嫩度和风味，还会降低肉的营养价值，造成严重的经济损失 [1] 。因此，开展肌肉保水性影响机制的基础理论研究，探索改善肌肉保水性的有效措施，不仅对探讨冷鲜肉汁液流失具有重要的理论意义，对肉制品加工也具有指导作用。【前人研究进展】肌肉中水分含量约为 75%，以结合水、
不易流动水和自由水 3 种状态存在 [2] 。肉的保水能力是肉的重要品质指标，通常用持水性（water-holding capacity，WHC）衡量。大量研究表明，畜禽屠宰后肌糖原无氧酵解、肌肉僵直收缩及蛋白氧化等因素均会影响肌肉的持水性。畜禽宰后肌糖原的无氧酵解，生成的乳酸会导致 pH 降低，当接近肌球蛋白等电点（pI 约为 5.4）时，肌肉蛋白的持水能力下降 [3] ；宰后肌细胞中 ATP 被消耗，粗丝与细丝之间形成横桥，导致肌肉僵直，肌丝空间减小，肌纤维中的水分被挤出至外部空间，造成水分流失 [4] ；蛋白氧化也能显著改变蛋白质的电荷效应和空间效应，从而影响肌肉的持水性 [5] 。Huff-Lonergan 等 [6] 研究发现，宰后肌肉的蛋白质降解也可能伴随着汁液流失；Lawson [7] 进一步研究发现，宰后肌动骨架蛋白和细胞膜之间的连接蛋白（intergrin）降解，形成汁液流失通道。但 Kristensen等 [8] 认为骨架蛋白质的降解会增强肌肉的持水性，Schäfer 等 [9] 研究得出肌肉骨架蛋白的降解与汁液流失无关。因此，关于肌肉蛋白降解与持水性之间的关系尚不明确。僵直后期，肌细胞的能荷降低，ATP 的缺乏，肌浆网中释放的 Ca 2+ 不能被重新吸收而大量积累，活化了对肌肉蛋白降解起到重要作用的钙激活酶（μ-calpain） [10] 。μ-calpain 能够降解肌肉蛋白，并使Z 盘崩解 [11] ，近年来关于 μ-calpain 对肌原纤维蛋白的降解多集中在肉的嫩化研究方面。【本研究切入点】国内外已有相关研究表明，肌肉蛋白结构的变化会导致蛋白-水相互作用改变，引起水分分布变化与迁移，进而改变肌肉的持水性。李银等 [12] 研究发现肌原纤维蛋白氧化引起的结构变化，蛋白水合能力下降，不易流动水“态变”为自由水；Christensen [13] 等研究发现肌原纤维蛋白的热变性使蛋白-水相互作用改变，蒸煮损失增加。但宰后 μ-calpain 介导的肌肉蛋白结构改变与持水性变化的内在联系，目前还鲜见报道。【拟解决的关键问题】以猪背最长肌（M. longissimus dorsi）为原料，通过分析宰后肌肉 μ-calpain 活性、肌原纤维小片化指数（myofibril fragmentation index，MFI）、肌原纤维蛋白的降解聚合、表面疏水性和溶解度等指标的变化，并借助低场核磁共振技术（low field nuclearmagnetic resonance，LF-NMR）分析宰后成熟过程中肌肉中水分的分布及迁移，阐释宰后肌肉蛋白理化特性变化规律及水分迁移机制，为冷鲜肉汁液流失控制提供依据。
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猪 宰后成熟 μ-钙激活酶 肌原纤维蛋白 水合特性 持水性 |
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猪 宰后成熟 μ-钙激活酶 肌原纤维蛋白 水合特性 持水性 |
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猪 宰后成熟 μ-钙激活酶 肌原纤维蛋白 水合特性 持水性 |
结论
猪宰后肌肉体系中μ-calpain与肌原纤维蛋白理化特性均呈动态变化，肌肉中不同状态水间发生相互迁移，引起肌肉持水性变化。宰后 24—120 h，μ-calpain对肌原纤维蛋白的适度降解导致蛋白水合力升高，自由水“态变”为不易流动水，肌肉持水性升高；宰后120—168 h，肌原纤维蛋白的持续降解，导致蛋白溶解度降低，疏水性增大，蛋白的水合能力下降，不易流动水又持续“态变”为自由水，肌肉的持水性降低。不易流动水与自由水也可以发生相互“态变”，引起肌肉中水分分布变化与迁移。
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