如何提高点突变的成功率？
如何提高点突变的成功率？
点突变是对目的蛋白从基因水平加以改造的过程。
如果课题中包含一个蛋白分子，经实验验证或是研究报道，改变其中的某些氨基酸会改良蛋白的某些性质，可以用到点突变的方法。
大体过程是：针对目的蛋白的氨基酸序列，设计引物做PCR,突变的氨基酸就在引物中，PCR产物即为突变后的DNA序列，如果目的蛋白是构建的质粒转染表达感受态，那可以选择目标蛋白的质粒为模板；PCR产物只是线性的片段，并且包含甲基化的模板，需要用DpnI消化酶消化掉模板然后重组，重组是将线性的片段重新变为完整质粒环的过程；最终，重组产物转染感受态扩增，涂抹抗性平板，然后挑单克隆摇菌测序。
需要做点突变购买点突变试剂盒即可，整个过程都会在试剂盒的说明书中，一些公司会提供引物设计的傻瓜式软件。如果按正常的实验过程，点突变三天就可以完成。但难以理解的是，无忌做了两个多月才搞定。最终的结果是，日子本来能过成日子，结果最后变成了月，差点成为季度。下面，倒叙一下点突变实验的长征路，望他人少走弯路：
首先是，成功的点突变平板，已经挑单克隆摇菌，测序比对正确。
这个成功的单克隆平板菌落状态是菌落弥散无黏连，挑菌摇瓶培养无恶臭。这个平板是已经用过从垃圾堆里捡回来再涂的，真是实验顺了都顺的不可思议。之所以出现这种情况是，无忌弥留之际，向含琼脂的LB培养基添加抗生素时加错，不得已从垃圾堆里捡回这几个平板，因为上一次重组质粒转染感受态在这几个平板上什么都没长。这里存在一个问题：用过的平板没长还能用么？说实话，这操作太骚了，没办法，那时那刻只能那么办。未测序前，无忌拿着长势良好的平板给师妹看，师妹一听是垃圾堆里捡回来的，立马走掉。这里想说的是，只有实验之后才能去说明可不可靠，因为这也关系到，实验出了差错还能不能止损。如果平板培养基中加错了抗生素，重组的样品扔掉，那损失了时间也损失了样品。对这次实验改进的地方是两点：重组时在冰上加各组分（之前没在冰上加也没事，只是实验大量失败后，更加注意细节）；换了公司补偿的小包装点突变试剂盒。但不能说明就是试剂的问题，因为，也购买其他公司的重组酶，结果还是失败。
下面是一些失败的重组平板：
这些平板的特点是菌落黏连，片状，摇菌后有脚臭味,出现这种情况一般就是杂菌了。
对于杂菌问题，无忌在实验中也做了改良，也存在大肠杆菌感受态转染效率低的问题。对于这两个问题，再次实验做到步骤精细，需要用到的实验用品再次灭菌，并重新制备感受态。最终结果还是失败。连续的失败加上需要验证自己的判断，无忌怀疑自己不会制备大肠杆菌感受态了，又从公司购买感受态，结果还是惨不忍睹。
对于点突变的PCR部分，一直做的比较顺利，PCR条带很单一，如图,左边是DNAmarker，最大分子量是5000，右边是PCR产物，只取了3微升产物电泳。
对剩余的产物添加DpnI酶消化后，条带如下，消化后发现亮度低了，但是胶回收后条带还是很清晰：
一直认为PCR这步没问题，验证了后续感受态问题，灭菌不彻底问题，抗生素添加培养基时培养基过热问题，平板问题（公司送的一次性平板），最终结果都是失败，这时候，唯一的问题就是对胶回收的样品进行重组这一步，没有验证重组酶是否存在问题，然而，这时候，再向老师反馈情况购买重组酶已经到了没有底气与脸面的时候了。没办法，最后硬着头皮向老师反应情况，老师也不再回复了。
按着无忌自己的思路，先去假定一个问题存在，然后设定一个解决这一问题的对照，最终的结果会反馈问题存在地方与解决方法的正确性，似乎做点突变就像是一个串联电路，有开关，有灯泡，问题就像是开关，而结果就是灯泡。灯泡不亮应该继续寻找开关。
老师对于再购买重组酶的问题没有决定，和另一个比较倚重的同学商量，同学提出查到的很多点突变不需要重组，当时正在实验的无忌很是气愤，跑到他们面前说：我们重组都做不出来，为啥不重组呢？他们没太在意这个观点，无忌内心很是挫败。经过这事，无忌突然意识到所谓的优秀，可能是因为能说而已，即使不被倚重，也不能说自己不优秀。
老师的顾虑也因其他实验人员直接将构建好的质粒转染感受态做不出来有关。无忌一直对这个问题持怀疑态度，质粒虽然拿去测序正确，但是并没有电泳看质粒状态如何，如果无忌自己构建成功并转染感受态不成功，才敢说转染这一步操作或是感受态有问题，但都验证没问题了。偏偏无忌连续失败，只剩下重组之一步购买重组酶对照了，别人又多出转染的问题，老师也无法相信谁并做判断了。但无忌相信自己，转染这步常规操作怎么会出现在做过很多次转染的人身上呢？况且，实验失败自然会对熟悉的操作更加严格要求。对于无忌的连续失败，他人提出“你是不是倒平板不行啊”、“你是不是不会涂平板啊”、“你不行让我来啊”等的声音，无忌无力反驳，只想努力做成功争一口气。但能深深体会到，有些人的优秀是找准点来显示优秀的，他们不做实验发表不出高深的质疑，但提出质疑就能显得高于实验失败人员一等，显得优秀。
最终，对六个样品的点突变都做出来了，购买重组酶验证结果还是不行，那时无忌才到了万念俱灰之际，彻底死心。没办法让公司帮忙做了两个点，无忌的结论只能是怪实验室风水不行了。再回到本文开始，其余样品的点突变成功依赖于公司重新给的试剂盒，很大原因是因为试剂的问题。回想这两个多月，真是惨呐。
把一件事情做成，不止是事情本身那么简单，做事的人还要承担别人的质疑、误解，而做为前行的人，又无力去反驳。不反驳倒也是好事，把心思用到事情本身，用到自我提升上，毕竟，自己真的成长了，抗挫折的韧性是有时间质疑我们的人所体会不到的。当以一个旁观者的姿态去看别人做实验的时候，无忌发现有些人失败一两次就开始发牢骚，失去耐心，而这对于失败二三十次才成功的自己，打心底里觉得这根本不值得一提，耐心有了，追求细致的心态也有了。
点突变是对目的蛋白从基因水平加以改造的过程。
如果课题中包含一个蛋白分子，经实验验证或是研究报道，改变其中的某些氨基酸会改良蛋白的某些性质，可以用到点突变的方法。
大体过程是：针对目的蛋白的氨基酸序列，设计引物做PCR,突变的氨基酸就在引物中，PCR产物即为突变后的DNA序列，如果目的蛋白是构建的质粒转染表达感受态，那可以选择目标蛋白的质粒为模板；PCR产物只是线性的片段，并且包含甲基化的模板，需要用DpnI消化酶消化掉模板然后重组，重组是将线性的片段重新变为完整质粒环的过程；最终，重组产物转染感受态扩增，涂抹抗性平板，然后挑单克隆摇菌测序。
需要做点突变购买点突变试剂盒即可，整个过程都会在试剂盒的说明书中，一些公司会提供引物设计的傻瓜式软件。如果按正常的实验过程，点突变三天就可以完成。但难以理解的是，无忌做了两个多月才搞定。最终的结果是，日子本来能过成日子，结果最后变成了月，差点成为季度。下面，倒叙一下点突变实验的长征路，望他人少走弯路：
首先是，成功的点突变平板，已经挑单克隆摇菌，测序比对正确。
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这个成功的单克隆平板菌落状态是菌落弥散无黏连，挑菌摇瓶培养无恶臭。这个平板是已经用过从垃圾堆里捡回来再涂的，真是实验顺了都顺的不可思议。之所以出现这种情况是，无忌弥留之际，向含琼脂的LB培养基添加抗生素时加错，不得已从垃圾堆里捡回这几个平板，因为上一次重组质粒转染感受态在这几个平板上什么都没长。这里存在一个问题：用过的平板没长还能用么？说实话，这操作太骚了，没办法，那时那刻只能那么办。未测序前，无忌拿着长势良好的平板给师妹看，师妹一听是垃圾堆里捡回来的，立马走掉。这里想说的是，只有实验之后才能去说明可不可靠，因为这也关系到，实验出了差错还能不能止损。如果平板培养基中加错了抗生素，重组的样品扔掉，那损失了时间也损失了样品。对这次实验改进的地方是两点：重组时在冰上加各组分（之前没在冰上加也没事，只是实验大量失败后，更加注意细节）；换了公司补偿的小包装点突变试剂盒。但不能说明就是试剂的问题，因为，也购买其他公司的重组酶，结果还是失败。
下面是一些失败的重组平板：
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这些平板的特点是菌落黏连，片状，摇菌后有脚臭味,出现这种情况一般就是杂菌了。
对于杂菌问题，无忌在实验中也做了改良，也存在大肠杆菌感受态转染效率低的问题。对于这两个问题，再次实验做到步骤精细，需要用到的实验用品再次灭菌，并重新制备感受态。最终结果还是失败。连续的失败加上需要验证自己的判断，无忌怀疑自己不会制备大肠杆菌感受态了，又从公司购买感受态，结果还是惨不忍睹。
对于点突变的PCR部分，一直做的比较顺利，PCR条带很单一，如图,左边是DNAmarker，最大分子量是5000，右边是PCR产物，只取了3微升产物电泳。
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对剩余的产物添加DpnI酶消化后，条带如下，消化后发现亮度低了，但是胶回收后条带还是很清晰：
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一直认为PCR这步没问题，验证了后续感受态问题，灭菌不彻底问题，抗生素添加培养基时培养基过热问题，平板问题（公司送的一次性平板），最终结果都是失败，这时候，唯一的问题就是对胶回收的样品进行重组这一步，没有验证重组酶是否存在问题，然而，这时候，再向老师反馈情况购买重组酶已经到了没有底气与脸面的时候了。没办法，最后硬着头皮向老师反应情况，老师也不再回复了。
按着无忌自己的思路，先去假定一个问题存在，然后设定一个解决这一问题的对照，最终的结果会反馈问题存在地方与解决方法的正确性，似乎做点突变就像是一个串联电路，有开关，有灯泡，问题就像是开关，而结果就是灯泡。灯泡不亮应该继续寻找开关。
老师对于再购买重组酶的问题没有决定，和另一个比较倚重的同学商量，同学提出查到的很多点突变不需要重组，当时正在实验的无忌很是气愤，跑到他们面前说：我们重组都做不出来，为啥不重组呢？他们没太在意这个观点，无忌内心很是挫败。经过这事，无忌突然意识到所谓的优秀，可能是因为能说而已，即使不被倚重，也不能说自己不优秀。
老师的顾虑也因其他实验人员直接将构建好的质粒转染感受态做不出来有关。无忌一直对这个问题持怀疑态度，质粒虽然拿去测序正确，但是并没有电泳看质粒状态如何，如果无忌自己构建成功并转染感受态不成功，才敢说转染这一步操作或是感受态有问题，但都验证没问题了。偏偏无忌连续失败，只剩下重组之一步购买重组酶对照了，别人又多出转染的问题，老师也无法相信谁并做判断了。但无忌相信自己，转染这步常规操作怎么会出现在做过很多次转染的人身上呢？况且，实验失败自然会对熟悉的操作更加严格要求。对于无忌的连续失败，他人提出“你是不是倒平板不行啊”、“你是不是不会涂平板啊”、“你不行让我来啊”等的声音，无忌无力反驳，只想努力做成功争一口气。但能深深体会到，有些人的优秀是找准点来显示优秀的，他们不做实验发表不出高深的质疑，但提出质疑就能显得高于实验失败人员一等，显得优秀。
最终，对六个样品的点突变都做出来了，购买重组酶验证结果还是不行，那时无忌才到了万念俱灰之际，彻底死心。没办法让公司帮忙做了两个点，无忌的结论只能是怪实验室风水不行了。再回到本文开始，其余样品的点突变成功依赖于公司重新给的试剂盒，很大原因是因为试剂的问题。回想这两个多月，真是惨呐。
把一件事情做成，不止是事情本身那么简单，做事的人还要承担别人的质疑、误解，而做为前行的人，又无力去反驳。不反驳倒也是好事，把心思用到事情本身，用到自我提升上，毕竟，自己真的成长了，抗挫折的韧性是有时间质疑我们的人所体会不到的。当以一个旁观者的姿态去看别人做实验的时候，无忌发现有些人失败一两次就开始发牢骚，失去耐心，而这对于失败二三十次才成功的自己，打心底里觉得这根本不值得一提，耐心有了，追求细致的心态也有了。
