【转载】抗体标记与检测指南

原文地址：新浪微博（http://blog.sina.com.cn/s/blog_8c500c730102xe41.html）

对于初次接触抗体标记的新手而言，面对文献中发表的诸多标记方法，难免产生困惑。到底这些标记方法的关键点是什么？在具体情况下该采用何种标记方法？根据传统的标记方法，我们有必要对化学修饰的原理有一个基本的了解，因为抗体和/或标记物在进行标记（结合）反应前需要化学活化。

本指南是一个用户友好的工具，可让您学习了解常见抗体标记方法的基本知识。同时还介绍了 Lightning-Link抗体标记技术，该技术极大简化了抗体标记步骤，利用该技术标记抗体不需要您具备太多化学方面的知识，并且标记的手头操作时间仅需短短的30秒！

抗体与标记物

抗体广泛应用于多种免疫分析中，用于检测和定量抗原。直接识别抗原的抗体被称为一抗（primary antibody），赋予检测的特异性。同时，在检测中还需加入标记物（详见后文“间接标记法 Vs.直接标记法”），标记物的加入赋予可检测性。表1中列出了一些常用的免疫分析技术，及可能使用到的标记物。

表1、免疫试验的类型及其相关检测标记物

直接检测法 Vs.间接检测法

检测技术可分为两大类：直接法和间接法。对于直接检测法，标记物通过共价键连接到一抗上。而对于间接检测法，标记物则是共价连接到与一抗特异性结合的二抗上。

在间接法中，检测由两个部分组成：第一步，用未标记的一抗进行孵育（通常1小时），(若存在抗原)部分抗体与抗原结合，未结合的抗体则通过洗涤去掉，然后加入标记二抗。再次孵育（通常1小时），洗涤去掉未结合的二抗。然后对结合在抗体上的标记物进行量化。若有抗原存在时，标记物通常导致有色物质的生成或某一个波长的发射光量增加。当无抗原存在时，则无一抗的结合，也无二抗试剂的结合，因此无信号产生。

在直接法中，标记物直接与一抗共价结合，因此仅需一轮孵育及洗涤步骤，而间接法则需要两轮孵育及洗涤步骤。直接法简化了试验的流程，但检测的灵活性降低。下表2列举出了直接法/间接法的主要利弊。

表2.直接法与间接法的利弊比较

尽管直接标记法具有诸多潜在的优点，但为何如今众多的免疫分析仍采用间接法原理呢?

无疑，最主要的原因就是直接标记一抗相对较复杂，确实从历来经验看，抗体标记都是由那些具有化学修饰技术的专业人员来完成的。在间接法中二抗试剂所起的信号放大效应究竟如何呢？是否直接标记法所产生的信号就很弱？其实在很多情况下，间接法的放大效应是让人产生错觉的。在与二抗试剂的孵育过程及洗涤过程中，一些一抗会与抗原发生解离，因此真正被放大的只是逐渐减少的一抗的量。其实在很多情况下，直接法也可获得与间接法相同甚至更好的结果。

抗体标记方法

抗体和所有蛋白一样，是由氨基酸残基组成的。蛋白的氨基基团（包括赖氨酸侧链和氨基端）通常被用于共价链接标记物。尽管在文献中报道了多种多样的标记方法，但实际上只有4种最常用的标记方法，且不同之处仅在于标记物被转换为反应性衍生物的方式。无论何种方法，几乎毫无例外的都是将标记物共价连接到抗体分子的赖氨酸残基上。

以下是4种最主要的抗体标记方法：

1.琥珀酰酯 (NHS)

当使用荧光染料标记时，通常可购买内配有NHS琥珀酰酯(也称为琥珀酰亚胺酯)的活化标记物。在适当条件下，活化的染料可与抗体分子反应（抗体分子通常含有多了赖氨酸基团）而形成结合物。过量的活性染料可通过多种方法去掉（通常采用过柱层析），然后标记抗体可应用于免疫分析。

2.异（基）双功能试剂 (Heterobifunctional reagents)

当标记物为蛋白分子（如辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP或藻红蛋白PE）时，由于抗体和标记分子具有多个胺，因此抗体标记流程略为复杂。在这种情况下，通常需要对其中一个分子（抗体）的一些赖氨酸进行修饰，以此创造一个新的反应基团（X），而标记物上的赖氨酸作为另一个反应基团（Y）。当抗体与标记物混合时，利用双功能试剂引入Y基团，随之与X基团发生反应，从而形成异二聚体结合物（即标记抗体）。关于双功能试剂标记抗体或其他生物分子的应用，您可以在数百篇文献报道中找到相关例子。

3.碳二亚胺（Carbodiimides）

这类试剂（EDC为常见的例子）在胺基和含羧基的分子间形成共价连接。Carbodiimides活化羧基，活化的中间体随后被胺基（由抗体分子的赖氨酸提供）吸附。Carbodiimides通常用于连接抗体和羧化的颗粒（如乳胶颗粒、磁珠），以及其他羧化的表面如微孔板或芯片表面。Carbodiimides很少用于将染料或蛋白标记物偶联到抗体上。

4.高碘酸钠（Sodium periodate）

这种化学物质对于绝大多数的标记物都是不适用的，但对于HRP标记却十分重要。高碘（Periodate）活化辣根过氧化物酶分子的糖链，从而形成醛基，后者可与抗体分子上的赖氨酸反应。由于HRP分子本身含有非常少的赖氨酸，因而相对容易获得抗体-HRP结合物，且无明显的HRP多聚化发生。

关于这4种抗体标记方法的详细介绍，有很多相关的专业书籍可供您查阅参考。

缓冲液及添加物--抗体标记的关键因素

在进行抗体标记前需要谨记的一点就是：您的抗体溶液中除抗体蛋白分子外，可能还含有其他物质如少量缓冲液、盐、可能还有其他蛋白及添加物。如果抗体事先已经过纯化，那么混合物与标记方法的兼容性则可不作为关键因素考虑，当然偶尔在进行标记反应前重新纯化抗体也是有一定必要的。纯化可能涉及稳定蛋白（如BSA）、低分子量物质如叠氮化钠，甘氨酸或Tris缓冲液等物质的去除。不同的添加物对不同标记方法的影响程度不同，但如前所述，绝大多数的标记抗法都是利用抗体分子上的赖氨酸残基，因此在标记反应中应避免含有伯胺的物质。例如，甘氨酸经常用于从抗原亲和柱上洗脱抗体，通过此种方法纯化的抗体在用于标记反应前，需要进行透析。需要特别注意的是，透析时如能更换2-3次缓冲液，那么去除小分子杂质的效率更高。这并不意味着您需要准备3倍或更大量的缓冲液一次性来透析，恰恰相反，多次透析延长了透析的时间，从而达到更好的杂质去除效果。如用1L的缓冲液透析3次的效果远比用5L的缓冲液透析一次的效果好。PBS、MES或碳酸氢盐（bicarbonate）为适合结合反应的缓冲液。最佳的反应缓冲液需要由标记反应的pH值要求来确定。

抗体浓度及纯度

大多数标记反应对抗体都有一个纯度要求（如>90%，>95%为佳）和浓度要求>0.5mg/ml。市售的许多商业化抗体一般都适合于标记，但并非所有情况都如此。比如，抗体可能以杂交瘤组织培养上清（TCS）、腹水或血清等形式提供。TCS通常含有多种其他蛋白和培养基营养物质（如氨基酸），这对于标记是非常成问题的。如果您使用的是TCS，那么纯化（如过蛋白A柱）步骤则是必需的。腹水和血清原液中的抗体浓度较TCS中的抗体浓度高，但同样也是不纯的，含有高浓度的氨基酸。进一步的纯化往往也是需要的。

在此，对上述内容做简要总结，到现在您应该已经了解到 (1)直接检测法与间接检测法的主要区别； (2)4种主要的抗体标记方法； (3)缓冲液形式和抗体浓度对标记的重要性。

实际上，在抗体标记技术迅速发展的今天，谁都可以使用一个手持移液器轻松的标记抗体。在下文将要讨论的Ligthening-Link一步法抗体标记技术便是如此。

Ligthening-Link ——世界上操作最简单的抗体标记技术

抗体标记过程的简化(主要是省去了过柱分离步骤)，解决了困扰着传统标记流程多年的诸多问题，如层析过程中物质的损失、批间差异以及难规模化等。

Lightening-Link抗体标记流程见图1。您仅需将待标记的抗体加入含标记物的冻干混合物管内，然后溶解管内物质以激活介导抗体标记反应的化学物质。由于没有纯化或分离步骤（反应的副产物完全良性），因此抗体的回收率近100%。而且，此标记反应仅需30秒钟时间即可建立。您可以登陆我们的网站，浏览抗体标记展示实验视频(Lightning-Link video)。

图1.Lightening-Link抗体标记流程

虽然抗体标记流程十分的简单，但化学途径却非常复杂，使抗体标记结合物在温和受控的过程中形成。用Lightening-Link标记的抗体性能与通过传统的多步骤方法获得的标记抗体性能相当，甚至更佳。见图2。

图2.用常规方法制备的结合物与Lightning-Link标记的结合物ELISA比较

Lightning-Link标记方法的简便性，可让您很容易的进行大规模或小规模的抗体标记。不论您需要标记少量或大量的抗体，手头操作的时间都相同——只需30秒。因为扩大抗体标记的量，与标记少量抗体原理相同，没有什么新的技术性差异（见图3）。对于新抗体，或者当您的抗体非常珍贵，或抗体的供给量非常受限时，Lightning-Link标记试剂盒可标记最少10ug抗体。其他常规的包装可标记100ug、1mg和5mg。

图3.利用Lightning-Link试剂标记不同规模的抗体ELISA试验比较

虽然抗体标记反应的操作方面非常简便。但如上文所述，在开始标记反应前，您仍需要考虑制备的抗体中是否有其他物质存在。所幸的是，Lightning-Link标记试剂对抗体中多种添加物具有耐受性。

图4.存在或不存在叠氮钠时标记抗体的ELISA试验比较

在商业化抗体中另一种常见的添加物就是作为稳定剂使用的BSA。您很容易会预料到在标记反应中，像BSA这样的分子会对反应产生严重的干扰，但BSA对Lightning-Link标记试剂的影响却并不太大。事实上，去除少量抗体中的BSA所带来的好处，可能被因纯化而导致抗体的损耗所抵消。例如，1%的BSA其摩尔量相当于1mg/ml抗体摩尔量的20倍，对于常规ELISA吸光度，当有BSA存在时，可按1/3，000(而非1/10，000)简单的稀释标记抗体来完成。见图5。

图5.有BSA存在时标记抗体的ELISA试验比较 如上文所讨论，有时抗体是以组织培养上清（TCS）或腹水的形式提供。Innova Bioscicence公司也提供系列抗体纯化产品，可让您制备的抗体与世界上最简单的抗体标记技术Lightning-Link相兼容。

AbSelectTM 抗体纯化系统可轻松去除不需要的一些物质，如可能干扰标记反应的蛋白和氨基酸。可用于从腹水或血清等原液标本中纯化抗体。

Antibody Concentration and Cleanup试剂盒可用于快速、简便的浓缩抗体。该试剂盒也可用于减少任何不需要的低分子量添加物的浓度。

Go Direct!

利用Linghtning-Link抗体标记试剂，可让您随心所欲的标记任何您所感兴趣的抗体，超过45种标记物任您挑选，为您的开拓性研究提供新抗体研究工具。直接标记抗体极大程度简化了免疫试验的步骤，且避免因使用标记二抗体而发生的交叉反应和非特异性结合等问题，所以直接标记抗体可让您获得更高质量的试验数据。直接标记可减少繁琐的孵育和洗涤步骤，这样可帮您节约大量宝贵的时间和经费。

更多阅读：德泰生物抗体标记（http://www.detaibio.com/topics/antibody-labeled.html）