上帝的手术刀：基因编辑简史——读书笔记
上帝的手术刀：基因编辑简史
达尔文的麻烦
农民们经常会发现，试图把几种优良性状集中起来的尝试往往以失败告终，而成功一般只会在漫长的等待和无数次的失败中偶然且随机地出现
孟德尔的做法几乎完全相反，他抛开了一切预设的学说和假定，单纯从豌豆杂交的现象出发，试图发现隐藏的遗传规律。
按照颗粒遗传理论，不管在哪一代豌豆体内，也不管豌豆表皮是黄是绿，“黄豌豆”遗传因子和“绿豌豆”遗传因子也都始终如一，发生变化的是它们组合的方式。
在百年间，孟德尔实验、埃弗里实验、赫尔希-蔡斯实验、DNA双螺旋以及梅塞尔森-斯塔尔实验，分别从几个方向上共同完成了对遗传因子的解密过程
从某种程度上来说，蛋白质就像是更加复杂的DNA。
大多数地球生物的DNA分子总是呈现双螺旋的简洁结构，而蛋白质分子的三维结构则变化多端、复杂莫测。
所有地球上的生命都使用了三碱基密码子来指导氨基酸的装配序列和蛋白质的生产。在无数种可能的编码机制中，生命恰恰选择了足够多样而又非常节约的一种编码方式
复杂生物的遗传物质足以编码数以万计的蛋白质分子。这个庞大的数字，也就是丰富多彩的生物性状的物质基础。
很多不直接参与蛋白质制造的DNA能够通过各种方式参与到蛋白质合成的调节中去，是它们保证了生物可以在合适的时间和地点生产出合适数量的蛋白质分子。
RNA为遗传的秘密提供了又一层新的复杂度。因为RNA的存在，蛋白质生产的时空调节可以通过RNA来进行
我们可以把一个活的生物体看成许许多多化学物质在三维空间里的时空分布——对于人体而言，这意味着差不多有近1023个原子，在以纳米为空间精度、微秒为时间精度的约束下完成排列组合。
所有这些时空组合的源头，却不过是区区30亿个碱基对组成的DNA长链。
而DNA复制和传递过程中出现的偶然错误——概率大约是1/109，反过来也可以赋予生物体足够的多样性，为达尔文的进化论提供基础
让人生病的基因
我们可以很有把握地说，所有疾病都和我们身体里的遗传物质，和我们从父母那里继承来的遗传信息，有着千丝万缕的联系。
即便这些基因在“正常”状态下工作，也可能会影响人体对疾病的敏感程度和抵抗能力
疾病光谱的一端散布着那些完全由遗传因素引起的疾病
一个可能的解释是，与携带两个变异基因拷贝的病人相比，仅仅携带一个CFTR变异基因的人不仅不会得病，反而会获得额外的生存优势，例如对霍乱、痢疾和肺结核的抵抗力。
也就是说，在漫长的人类进化历程里，北欧人群是靠着牺牲1/4“不幸”孩子的健康乃至生命，以及1/4“娇贵”孩子的生活质量，来确保另一半子孙后代能够躲过时不时在村庄部落里肆虐的传染病，从而生长繁衍下去的。进化做了这么一道残酷的算术题，1/2的存活概率总比全部活不下去好。而这，可能也是许多单基因遗传病至今仍然存在的原因之一。
在疾病光谱中央地带分布着的，是大量由许多遗传变异共同影响，同时也受到环境因素影响的复杂疾病。
困扰现代社会的各种“现代病”，包括高血压、高血脂，精神类疾病如抑郁症等，也都是复杂遗传因素和环境因素相互作用的结果。
从基因疗法首次被应用于人体的1990年算起，全世界通过基因治疗得以重获健康的幸运儿不超过千人
这种被称为“重组DNA技术”的革命性发明在20世纪80年代后被广泛应用于许多蛋白质药物的生产中。
站在2017年回望过去，在整个20世纪90年代中，与其说基因治疗带来了希望，不如说带来了喧嚣和泡沫。
实际上，许多感染性疾病之所以凶险致命，并不是因为病毒本身，而是因为人体免疫系统对病毒的剧烈反应。
基因治疗不是可以任由科学家和医生们随意挥舞的神奇手术刀。有一些人类还远没有完全理解的生物学机制，为基因治疗的全面应用套上了紧箍咒。
“缺啥补啥”遇到的新问题
与传统基因治疗的思路不同，基因编辑的逻辑在于通过某种外科手术式的精确操作，精确修复出现遗传变异的基因
目前在生物医学领域大行其道的重要工具，绝大多数都来自大自然的鬼斧神工，而非实验室中的人工设计。
转录因子蛋白的看家本领，就是准确识别和结合特定DNA序列的能力
这一特性保证了转录因子可以精确地调控一个基因在不同时空中的活性。
如果对天然存在的锌手指蛋白拆散重组，可以获得全新的基因组定位能力。如果有足够大量的锌手指蛋白组合，我们甚至可以从中创造出针对任意长度、任意组合的碱基序列的锌手指蛋白来
生物化学家的最高理想，就是把生命体拥有的化学物质找出来，按照一定比例把它们混合在试管里，小心模拟细胞内的环境条件（像是温度、酸碱度、各种离子的浓度等），在试管中重新“创造”代表生命现象的化学反应
对于RNA生产来说，除了DNA、RNA聚合酶和碱基原材料，至少还有一些重要的东西隐藏在黑暗中。这些被忽略的东西偷偷地隐藏在染色体之中，很有可能就是某个能够和DNA结合的蛋白质分子
能够帮助RNA聚合酶在裸露的DNA分子上启动RNA合成的“辅助”蛋白。这些蛋白质分子被赋予了一个全新的名字——转录因子
哪些手指组合值得留意？到底怎么计算两根手指的相似性？这些问题筑起了高高的技术壁垒，直到今天，筛选组装出一套好用的锌手指也不是一件轻而易举的事情。
锌手指核酸酶
要保证这几十万亿次的DNA复制不出差错，保证DNA分子在各种高能射线和化学毒物的持续攻击下不出问题，我们的细胞进化出了各种各样的DNA修复机制，可以敏锐地发现刚刚露苗头的任何错误，然后第一时间把错误碱基替换掉。
当锌手指核酸酶在基因组中找到合适的位置并进行剪切之后，细胞自身就可以完成缝缝补补的针线活。
专利保护的含义就是专利发明人以公开自己的新发明为代价，换取国家层面对自己金饭碗的保护
而对于整个医药市场来说，监管的要求使得技术秘密几乎没有容身之地。
各个国家的监管机构都对医药产品的研发、临床试验、生产销售，以及市场推广等各个环节提出了严苛的监管要求，以防医药公司利用巨大的信息不对称欺骗患者
既然要监管，那就理所当然要知道医药产品的所有技术细节，对一个藏在保险柜里的秘密是无法进行监管的。
技术秘密在医药市场上无法立足还有一个原因，即许多医药产品是非常容易通过反向工程理解其中的奥妙的。
在一个完全自由竞争的丛林世界中，制药公司开发出的新药分分钟就可能被虎视眈眈的竞争对手轻易模仿制造。
药品监管法规要求药品生产商披露产品的主要活性成分。
因此，对于医药市场来说，国家提供的专利保护是产品创新和企业生存的命脉所在
一般在药物开发的早期，公司就会为它们申请专利。在包括中国、美国和欧盟在内的世界上大多数国家和地区，创新药物拥有20年的专利保护期。考虑到现代药物开发的周期均长达七八年甚至10余年，20年的保护期不算离谱，它至少保证了医药公司能捧10年左右的金饭碗
为了进一步鼓励医药创新，各国监管机构往往还会通过行政手段，保障和促进特定药物的开发工作，例如在专利保护期外施行所谓的“市场独占权”
从某种意义上说，国家是给发明人提供20年的金饭碗从发明人那里换取新发明的公开
国家层面的算盘是这么打的：给药物开发者10年左右的时间独占市场，通过高额回报鼓励医药创新。但在专利保护期后，专利失效，仿制药厂家的进入会快速降低药物价格，减轻患者和医保买单方的财务负担，让全体人民共享技术进步的成果
也正因为如此，我们在医药市场上看到的是高低端搭配的产品组合：有钱人可以第一时间尝试最新的药物治疗方案，而穷人也可以在众多廉价但亦有确切疗效的药物中选择
这家年年烧钱的小公司在20年的时间里成功地把锌手指核酸酶技术及其相关临床应用锁进了由一系列专利打造的黑箱，把它变成了一个其他任何公司无法染指的垄断市场
20年来，他整合了关于锌手指核酸酶从设计、优化到临床应用的整套技术体系，并成功利用专利壁垒将所有人拒之门外。
2003—2004年间，圣加蒙公司终于获得了包括锌手指核酸酶的设计、筛选、优化、实验室和临床应用相关的一揽子关键专利，把一场发端于大学校园的技术革命，成功变成了一场只能由圣加蒙公司上演的独角戏。
医药产业的专利保护制度（或者可以拓展到整个专利保护制度），试图在鼓励、保护创新与保障大众健康需求之间取得一定程度的平衡
没有专利保护，医药开发者的巨额研发投入得不到利益回报，将严重打击药物研发企业开发新产品、新技术的积极性。而专利保护过强造成的垄断，则会产生高昂的医疗开支，损害大众基本的健康和生命权
历史的事实是，圣加蒙公司的垄断措施实际上显著延缓了整个锌手指核酸酶领域的技术进步
由于圣加蒙公司对自身的独门筛选平台严加保护，其技术细节完全不为学界所知。那么可想而知，对锌手指蛋白的筛选组装技术，学术界也就没有办法在圣加蒙公司平台的基础上进一步完善和改进了
放弃整个学术界的智慧和资源，仅靠圣加蒙公司内部的区区百来位科学家，要想实现技术的飞速进步又谈何容易
如果将锌手指核酸酶的相关专利对整个学术界和工业界开放，全球各地的大学、研究所和医药公司一定会争先恐后进入这个领域，在协作和竞争中不断改进锌手指核酸酶技术的安全性、治疗效果和疾病谱。那么到今天，我们大概有理由相信这个领域早已在不同的疾病领域开花结果、福泽众生了
开源破牢笼
锌手指组合的可编程性是不完备的
而在“神话”蛋白中，34个氨基酸组成一个“神话”手指，精确对应一个DNA碱基。
“神话”蛋白具备完全可编程性。通过删减、添加和自由组合不同的“神话”手指，可以轻而易举地定位任意长度、任意序列的DNA片段。
和锌手指核酸酶系统不同，“神话”手指和DNA碱基乃是一对一的对应关系。每一段“神话”蛋白对应一个DNA碱基。如果将“神话”蛋白组装后与FokI剪刀相连，就可以实现DNA特定位置的切割和编辑。
2011年，张锋和合作者设计并组装出了全新的“神话”蛋白，并证明它可以精确定位人类基因组并调节邻近基因的表达。
2011年，人类正式开启了基因编程时代
基础研究到临床应用之间的距离往往十分漫长——彼此之间隔着十几二十年的时间、数十亿美元的投入，以及难以预测的运气因素
CRISPR记录下的病毒，恰好是专门入侵细菌的病毒
细菌的免疫系统和人体一样，居然还有自我进化的高级功能，每当有新的噬菌体病毒入侵，侥幸存活下来的细菌就会把它的基因组序列整合到自己的CRISPR序列中
CRISPR序列也能被转录成RNA分子。这些短短的RNA分子会和细胞内的某种蛋白质结合（这类蛋白也因此被称为cas蛋白，也就是CRISPR结合蛋白的意思），像哨兵一样在细胞里终日巡逻
这位哨兵寻找的对象，是任何一段能够和CRISPR RNA完美配对的DNA分子。一旦两者相遇并结合，哨兵就会启动cas9蛋白的切割功能，将这段DNA切成一个个小的片段
也就是说，细菌的全套免疫系统，仅仅就是一个自带切割功能的蛋白质，一段自带识别功能的RNA。
与细菌相比，复杂生物的DNA识别机制竟然是如此低效。我们说过，锌手指识别DNA的效率是1:30，而“神话”蛋白更是低至1:102。而细菌的CRISPR识别DNA的效率是1:1，这是在理论上就无法逾越的识别效率
如此惊人的识别效率，是因为CRISPR完全避免了DNA和氨基酸之间的转换，完全依赖RNA而不是氨基酸序列实现对DNA的识别
解析一个拥有七八个蛋白质分子、好几段RNA片段的庞大蛋白复合体结构，直到今天在技术层面都还相当困难。
我们可以把cas9蛋白想象成有着两个卡槽的接线板，卡槽内能够同时插进一条CRISPR RNA和一条病毒基因组DNA
当插入的CRISPR RNA和病毒DNA的序列一一配对时，cas9蛋白就会发生变形，准确卡住病毒DNA，毫不犹豫地挥起剪刀。这正是细菌免疫系统的工作原理。
CRISPR/cas9技术的从天而降，宣示了“神话”技术的终结
杜德纳和卡朋特的发现不仅仅是一项基础研究成就——尽管这项成就几乎肯定会获得诺贝尔奖。如果这项技术确实如两位女科学家所言那么高效便捷，也许整个基因治疗市场会被重新定义
从工具准备的角度看，设计和制造一个用于基因组定位的RNA片段，对于任何一个稍加训练的生物学研究人员来说都是易如反掌的事情，远远简便于锌手指蛋白和“神话”蛋白的组装
在工业和临床应用中，易如反掌就意味着低门槛，高效率就意味着低成本和短周期。而这些优势也就意味着新的CRISPR/cas9技术，会把许多不可能都变为可能。
利用CRISPR系统实现对特定基因的破坏、修复、关闭和启动；对cas9蛋白和向导RNA的不断优化（以提高效率，降低差错率）；多线程的CRISPR/cas9；利用CRISPR/cas9系统尝试治疗疾病（已经尝试过的疾病类型包括癌症、肥胖症、艾滋病、乙肝，以及包括镰刀形红细胞贫血症在内的各种遗传病）；利用CRISPR/cas9系统研究基础生物学问题（包括用于大规模遗传筛选和制造各种基因缺陷的动物模型）
在一项2016年10月开始的临床试验中，中国的科学家们将肺癌患者的免疫细胞提取出来，利用CRISPR/cas9技术修改了细胞中的一个基因，再将这些细胞注入患者体内。他们期待，经过基因改造的免疫细胞能够攻击患者体内的肿瘤。
有市场分析认为，几年之内以CRISPR/cas9系统为基础的基因编辑市场会达到每年数十亿美元的规模。而更乐观的估计则认为，这是一个年销售额接近500亿美元的庞大市场。
2014年4月15日，美国专利与商标局在万众瞩目中，将与CRISPR/cas9技术相关的第一项专利，授予了张锋和他所在的布罗德研究所
布罗德研究所靠这项专利不光可以坐拥主动送上门来的滚滚专利许可费，而且可以从源头上控制整个基因编辑和基因治疗产业
布罗德研究所的律师们在提交专利申请时，大概是意识到己方已经严重落后，因此特别申请了美国专利与商标局的快速审批通道
在世界上绝大多数国家的专利法系统里，如果出现不同的人或实体试图申请同一类东西的专利时，一般遵循的是谁先提交申请谁就能获得专利的规则（“frst-to-fle”）
美国长久以来采用的都是所谓谁先发明谁就能获得专利的规则（“frst-to-invent”）
什么样的发明创造才能申请专利呢？大致而言，各国的专利法都规定，只有满足以下三种情况的申请才会被授予专利：新颖性、创造性和实用性
创造性，可以理解成如果一个发明创造尽人皆知、显而易见，就不该获得专利
如果一个发明创造显而易见，根本不需要人为去推动和鼓励就能出现，那自然也就不值得为此付出“纵容”垄断的代价了
意想不到的突破
首先必须说明，不管从传统基因治疗到基因编辑概念的突破有多深远，也不管CRISPR/cas9技术的应用潜力有多大，基因治疗和基因编辑领域都还远没有达到真正瓜熟蒂落、高枕无忧的时候
一个广为诟病的潜在麻烦就是它的脱靶效应：当你精心设计一段向导RNA序列，试图精确破坏或修改某一个基因的时候，这套系统却有可能会错误切割目标打击范围之外的基因序列
基因编辑技术给人类社会带来的第一个革命性改变，来自一个你们可能完全意想不到的方向——转基因食品
在过去五年间，已经有几种利用基因编辑技术开发的农作物进入了大田试验，乃至已经进入市场
在所有这些基因编辑产品中，都没有引入任何来自其他物种的新基因。也正因为这一点，美国农业部已经屡次宣布，基于基因编辑技术生产的农作物和食品，不适用针对转基因农产品的严格监管
新一代的基因编辑技术注定将要反复刷新我们的认知，改变我们的生活。对科学研究如此，对农业生产亦是如此
2016年年底，世界上第一例CRISPR/cas9人体试验在中国四川大学华西医院启动，他们的攻克目标是肺癌
他们计划通过改造患者的淋巴细胞，让它们重新获得捕捉、消灭肿瘤细胞的能力，以达到治疗肺癌的目的
对于基因治疗来说，淋巴细胞的这种流动性提供了巨大的方便之处。想要对淋巴细胞进行基因修饰和基因编辑，只需要从患者的外周血里提取淋巴细胞，修改好后再把细胞重新输回给患者就可以了
因此，在我看来，对基因做手术在人体上最容易实现，也最有可能在近期正式走入临床应用的，就是针对淋巴细胞的操作——不论是直接与淋巴细胞相关的疾病，还是通过改造淋巴细胞治疗其他疾病
我们可以把这个阶段简单总结为“来自人体—体外处理—体内治疗”
自然而然的，未来我们可以期待一下基因编辑的第二阶段——“来自人体—体内处理—体内治疗”
因此，在“体内处理”的实践中，怎么让病毒颗粒真的“渗入”相关器官和组织的最深处，保证能把DNA手术刀运进全部或者至少是相当一部分细胞内，其实是非常困难的
“来自人体”这一步骤对于基因手术来说，意味着完全个性化的治疗方案
每一个步骤都必须根据这名患者的情况量身定做，不同患者之间不可能共享医疗资源
基因治疗的经济压力非常沉重
基因治疗这把上帝的手术刀，如果真的想要普惠众生，摆脱对“来自人体”的依赖，“去个性化”是非常关键的一步。只有这样，医药企业才有可能开发和大批量生产出能用在不同患者身上的普适药物，而不需要针对每个患者都设计一套烦琐和独一无二的治疗方案。也只有这样，基因治疗的价格才有可能下降到普通大众能够承受的范围。
基因治疗和基因编辑技术应用的边界在哪里
一旦“治疗”和“预防”之间的栅栏被打开，“预防”到“改善”的窗户纸更是一捅就破
基因编辑未来推演的尽头，是直接对人类生殖细胞进行编辑。毕竟，这时进行基因修改和编辑的效率是最高的，只需要修改一个细胞，长大成人后身体内上百万亿个细胞就都会携带新的遗传性状
说异化，是因为一旦走上这条道路，人类就将开始摆脱自然历史留给我们的印迹，开始进行对自身的自我创造
说毁灭，是因为我们从生物进化历程中学到的教训是，地球环境变化万千，适者生存没有一定之规，只有保持变化才是生命长青之道。因此丰富的基因库是一个物种生存繁衍的基石
基因编辑的广泛应用，可能会毫不留情地去除那些对于当下生活环境有害的基因突变，这毫无疑问将消灭人类基因库的多样性
说到底，基因编辑这把上帝的手术刀，所针对的对象是人类的遗传物质——决定人之所以为人的物质。可想而知，对这种技术手段的推进，最终一定会从科学走向伦理学，触及人的定义、人类个体的独立性等终极问题
伦理观总是滞后于科学发现，甚至也滞后于社会变化本身
一个人类胎儿是否被当成“人类个体”实际上存在极其复杂的判断标准，不仅取决于他/她有多大，还取决于他/她的母亲身处哪个年代，又居住在哪个国家哪个州
我们应当首先承认伦理观本身的多元化和动态性，以期从中达成科学进步与伦理观念的协调
与其说伦理，不如说监管。我的看法是，涉及应用于人类自身的技术时，必须在严格的专业监管和法律约束下进行
单纯禁止科学家合法研究某一项技术，往往会把相关技术研究推向暗处
后记
2017年初，美国国家科学院更是发布了《人类基因组编辑：科学、伦理和管理》的重磅报告，首度对基因编辑人类松口。科学家和管理者们建议，在“严格的监管和风险评估下”，基因编辑技术可以用来改造人类的生殖细胞和胚胎
技术也许是中性的，但是技术的应用却可能创造一个魔鬼出没的世界
