半巢式PCR材料试验方法流程介绍

一、引言 巢式PCR是利用第1轮PCR产物作为第2轮PR的模板,除使用第1轮的1对特异引物之外,在第2轮PCR反应中,使用1对新的特异引物,它们与模板DNA的结合位点处于第1轮引物扩增出的DNA片段内,这样在第2轮中错误扩增的可能性极低。半巢式PCR与巢式FR原理相同,只是在第2轮PCR反应中使用的引物有1条为第1轮PR的引物,这种利用三条引物进行两次PCR扩增的方法称为半巢式PCR( semi-nested PCR),半巢式PCR与巢式PCR应用条件基本相同 二、材料 ①模板:基因组DNA或cDNA。 ②dNTP混合液:每种脱氧核糖核苷酸的浓度为2.5mmol/L ③三条特异引物:两条外引物,一条内引物,浓度均为10mol/L ④ Taq dNA聚合酶及其19×PCR缓冲液。 ⑤高压灭菌去离子水。 ⑥用于琼脂糖凝胶电泳的试剂 ⑦PCR扩增仪。 三、方法 1.引物设计 在某些情况下,由于所要研究的基因位于整个基因组的5′末端或者3'末端,这样在基因的5末端或者3末端就无法设计出两条引物一外引物和内引物,只能设计出一条引物,而在基因的另一端仍然可以设计两条引物,在两次PCR中有一端的引物要利用两次,半巢式PCR的引物设计原则与常规PCR相同,共设计三条引物。内引物与外引物间隔多长距离没有统一的要求,具体情况根据每个实验而定。 2.模板 一般使用经过提取的基因组DNA,或由反转录形成的cDNA 3.操作方法 ①进行第一轮PCR反应,50p的PCR反应体系,在0.25ml的PCR管中,分别加入 10×PCR缓冲液 5ul DNA模板 3ul 2.5mmol/L的dNTP混合液 1ul Tag dNA聚合酶(5U/l) 3ul 10mol/L的外引物(P1,P2) 各1ul H2O 至50ul 如果PCR仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油(约50pl)。将PCR试管放入到PCR仪上。 ②设置PCR反应条件:

PCR反应中的温度要根据具体反应而定,一般来说每分钟合成1000左右。 ③进行第二轮PCR反应,在0.25ml的PCR管中,分别加入 10×PCR缓冲液 5μl 第一轮PCR扩增产物 3ul 2.5mmol/L的dNTP混合液 1ul Taq DNA聚合酶(5U/l) 0.5ul 10ymol/L的外引物(P1或P2)和各1ul H2O 至50ul 内引物PCR反应条件同第一轮,反应中的条件与循环数视具体情况而定。 ④有些情况下,也可进行一管式半巢式PCR,例如50l的反应体系,分别加入 10×PCR缓冲液 5μl 模板 3ul 2.5mmol/L的dNTP混合液 1ul Tag DNA聚合酶(5U/pl) 0.5ul 10umo/L的外引物(P1、P2、P3)各1ul H2O 至50ul PCR反应条件同第一轮,反应中的条件与循环数视具体情况而定反应结束后,用10μ第二轮PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。 四、注意事项 半巢式PCR较巢式PCR反应特异性有所降低,易造成非特异产物,为了克服这个缺点,可以采取提高退火温度,从常用的55℃提高为60℃。从而使模板与引物之间的识别特异性提高,以提高反应的特异性。半巢式PR多釆用第一轮产物直接稀释作为第二轮循环模板,此稀释混合物中的引物和模板对于第二轮扩增有一定干扰作用,易造成背景高、非特异产物多的缺点,通过对第轮产物的初步分离获得纯化的核酸产物,再作为第二轮循环模板可得到更为理想的结果口。 五、应用与小结 用于当模板DNA含量较低时,一次PR难以得到满意的结果,需要进行两轮PR扩增,与巢式PCR相比,在基因的5末端或者3末端无法设计出两条引物外引物和内引物,只能设计出条引物的情况下,宜采用半巢式PR。王缚鲲等使用半巢式P(R确诊56例患者胃黏膜中存在感染;闻伟刚等采用半巢式PCR技术建立了食品中痕量及微量转基因大米成分的检测方法