麻省理工学院公开课：分子生物学导论
第15课：重组DNA（一）
喜大普奔！我家Eric S.Lander教授回来了！没有比较就没有伤害，这一课实在太精彩了！顺手一搜，Eric不仅是Broad研究所创始人和主任，还是人类基因组计划主要负责人，这个量级的科学家竟然能把生化基础课程教授得如此通俗易懂，男神！嫁了！
1、克隆的过程：在特定位点切割出一段段基因序列，连接到另一段可在细菌中复制的、称为载体的DNA上，然后介导至宿主细菌细胞中。理想情况下，每个细菌都携带一个这样的DNA分子。再把细菌细胞涂抹到平皿上培育，选出携带人类DNA的细菌形成“克隆文库”，或称“重组文库”。（实验设计思路是，平皿只能让摄入人类DNA片段的细菌生长，以确保此后每个菌落都是单个摄取了人类DNA的细菌后代）
2、如何切割DNA：使用限制性酶。限制性酶是能在特定位点切割DNA的酶，如EcoR1可识别并切割GAATTC序列；BamH1可识别并切割GGATCC序列，HinD3可识别并切割AAGCTT序列，MBo1可识别并切割GATC序列等等，细菌已演化出成千上万限制性酶用于一对一识别4、6、8个字母的特殊序列。（鉴于原核生物已经演化了几十亿年，人类所探寻的生化机制都能在细菌身上被发现，所以教授说啦，有啥问题就问细菌准没错）
3、限制性酶识别基因序列后打断双链并携带一段悬伸部分，悬伸部分的两端序列也是相互匹配的。细菌演化出限制性酶是为了对抗噬菌体——识别病毒的特定序列并切除它们。但在细菌自身的DNA中，也存在相同的序列，为了避免自切，自身序列会被甲基化修饰（也就是失活啦，表观基因学再度佛光普照），以避免与限制性酶结合。简言之，细菌演化了出复杂的自我防护机制——既有限制性酶也有同宗的甲基化酶，前者负责切割特定序列，后者使细菌自身序列得以通过甲基化被保护。但是偶尔，甲基化酶也会错误地与病毒序列结合，使病毒免疫。（这种情况下，细菌就一命呜呼啦。细菌和病毒的撕逼大战嗷嗷打了三十多亿年，充满了各种精彩的偶然和猝不及防的状况外）
4、如何连接DNA：使用连接酶。细菌演化出连接酶用于修复自身断裂的DNA，人类利用连接酶粘贴出人造DNA序列——取一段包含复制识别位点序列的DNA，连上拥有复制起始位点的载体，就可以在细菌细胞中实现复制。
5、大多数细菌细胞内除了具有染色体外，还存在一些DNA小环，称为附加体（质粒就是一种附加体）。附加体实质上是具有自主复制功能的DNA，有复制起始位点，通常是对抗真菌抗生素的抗性基因，如青霉素抗性基因、链霉毒素抗性基因等，可以在细菌间直接交换、摄取，使抗药性得以在菌群中迅速扩散。（只需随意薅隔壁菌一个质粒就能瞬间晋级为耐药菌，微生物所向披靡的生存能力，人类只配跪着仰视哟）
6、从EcoR1位点切开从细菌中纯化出的质粒DNA，再取同样用EcoR1切割的人类DNA片段，用连接酶将二者粘贴，就能获得一个具有自主复制功能的人造DNA序列（全靠质粒有复制起始位点，和细菌精巧的自主过程相比，人类的生化实验操作简直像挥舞着巨型棒槌切葱花，粗鲁丑陋且错漏百出，难看极了）
