时间分辨荧光免疫分析及其应用前景

放射免疫分析法的灵敏度高、特异性强，因此它使体内超微量活性物质的分析获得了巨大发展。但是它也有一些缺点，如操作带有放射性}由于投衰变导致标记物存放时闻短，以及由于找不到此。I更合适的核素，其是敏度的进一步提高受到限制等。因此，近年来，非同位素免疫分析沽应运而生，发展很快。主要有酶免瘦分析、发光免疫分析和荧光免疫分析等，其中被公认最有发展前途的一种是八十年代初发展起来的时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)。它用镧系元素作为示踪物标记抗原或抗体，利用时间分辨荧光测定法排除样品中非特异性荧光干扰，从而有效地提高了测量的灵敏度此外，它的特异性、动态范围、测量速度及标记物的稳定性等均优于其它非放射性免疫分析法。不少作者对其概念、成就和前景作了评述[1’5)。

基本原理

TrFIA是利用具有双功能基团结构的整合剂将镧系元素标记到抗原(或抗体)上，经免疫反应与抗体(或抗原)形成免疫复合物。由于结合于免疫复台物的镧系元索能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时厨分辨荧光仪即可测量样品中镧系元素发射的荧光强度，从而确定待分析物的量。

TrFIA有两种分析系统，第一种称为解离增强镧系荧光免疫分析(DELFIA)。此法需要具有双功能基团结构的螯台荆，使其一端与镧系元素联结，另一端与抗体分子上的自由氨基联接，制成Eu标记抗体，它与待测样品中的抗原结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元索的荧光强度就能确定样品中抗原的量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhaneemen~solution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并为增强{受中所含的另一种螯合剂所螫合，形成新的螯合物，从而在紫外等光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪铡定其荧光强度，即可确定抗原的量。该系统前后用了两种不同的整合莉，前一种要满足对抗体标记的要求，后一种则要j茼足受光测定的要求。

第二种是一次螯合固相分析系统，文献上多称CyberFluor分析系统。它经由一种具有双功能基团结构的新型螯台剂BCPDA[4，卜敷(氧磺酰基苯基)一1，i0q#略悻一2，9一二羧酸]霉亲合素与镧系元素连接，作为通用试剂。再把抗体与已被活化的生锄素结合起来，通过生物素与链霉亲合素的鳍合，完成抗体的标记e8]。若用夹心，撮终形成的免疫复合物是抗体t一抗原(标准或样品)一(抗体r生物素)一(链霉亲台索一BCPDA-镧系元素)。以固相形式，用CyberFluor615型时间分辨荧光仪测荧光强度，以确定抗原的量。此法特点是利用生物索链霉亲台素系统的反应生物放太作用和高亲和力特点，只经一次螯合并以固相形式测定荧光强度。

第一种分析系统比较成熟，但第二种分析系统发展也较快。以下以第一种分析系统一伪重点加以叙述。

镧系元素螯台物的荧光特征

TrFIA中使用的镧系元素有Eu(铕)、Sm(钐)、Tb(铽)、Nd(铌)和Dy(镧)等，其中以Eu最为常用。以下叙述以它为倒。Eu等镧系元素被适宜的紫外光吸收配位体(即增强液中的螯台剂)螯台，受习紫外光、激光和氙灯等光的激发而发射荧光时，有以下特征(13]：激发光与发射光之间有很大的斯托克斯(stokes)位移(见表1)，如Eu”一2一NTA，其激发光为340nm，而发射光为613nm，stokes位移为273nm(闰1)，而普通荧光标记仅为28nm，这样就很容易把激发光和发射光分开，@激发光谱带较宽，可增加激发能，提高灵敏度}发射光的谱带很窄，50％发射的谱带宽度<10rim，这样可以利用

613+5nm附近的通带滤波器，只允许此波段内荧光通过供测量，而排除其余波长的荧光，能量损失也不太大，而且在此波段内来自生物佯品的荧光最小，从而有效地降低了本底荧光，荧光衰变时间长。如Eu”一2一NTA的荧光衰变时间为714gs，而Eu“一PTA甚至达到925~ts．相比之下，样品中一些蛋白质的荧光衰变时闯很短，仅为l~10as‘藏2)，相差5～6个数量级。这样在时厨分一辨荧光仪上，当脉冲光源激发之后，可以适当延迟一段时间，待血清、溶剂、样品管和其它成分的短半衰期荧光完全衰变后再测量，使所测到的本底荧光主要来自非特异结合，从而极有效地降低了本底荧光(图2)。而普通荧光免疫分析所以出现高本底荧光，主要是由于样品巾蛋白质和荧光素两者的发射光谱有较大部分重叠所致，荧光标记的相对比活性高[1]。正是以上这些特点，使TrFIA有很高的灵敏度(表3)和特异性。

Eu的光谱性质

Eu原予基态的外层电子结构是46s2．它失去3个电子后，形成4f结构稳定的Eu“．Eu”与卤化物，磷酸盐、硫酸盐和硝酸盐可形成弱的络台物。在水溶液中，Eu”艘8～lO个水分子所包围这些水分子对Eu”所发荧光有严重的猝灭柞用，但可被许多无机或有机的配位体除去。这些配位体还影响络台物的荧光性质。

当用强辐射激发Eu时，Eu自身会发射荧光，但其量子产额很低。只有Eu被适宜的整合剂整合，才能形成量子产额高的螯台物。它们的一大特征是：配位体在特征波长上吸收辐射，而Eu”在特征波长上发射辐射。这是由于能量是从配位体转移到Eu”的。有机配位体吸收能量，使分子处于单线激发态，它或由辐射跃迁(配位体荧光)或由非辐射跃迁从激发态Sl返回到基态S或者变成三重态T-．三重志分子或者经由T-一So辐射(分子磷光)或经非辐射过程返回基态，也可以把能量转移给被激发的金属离子如Eu“。激发态Eu"占优势的辐射舐迁是最低激发态Do—F2，发射袋．光波长为r613rim，这是我们的观察对象。

Eu螯台物的荧光寿命在lo。～1On嘁者更长，主要是由Eu”的D0态的半意劝决定一的，虽然它也受配位体、．环境温度和存在的试剂的影响。而上述的S1一so，S1一Tl等的辐射跃迁q要比D+F2的辐射跃迁快几个数量级。所以这些跃迁所产生的荧光、磷光并不干扰Eu”的荧光。。

为使上述能量转移过程顺利进行，应满足如下要求：(1)非辐射跃迁及SI-=~S0和T1一s0的辐射跃迁应是最小的，(2)金属离子的共振能级的能量应接近，而且最好略低于配位体三重态的能量}(3)激发态金属离予的无辐射跃迁几率应是最小的可见能量转移过程与配位体特性密切相关，也就成为我们寻求良好配位体的重要依据之一。

镧系元素Eu标记抗体

制备Eu标记的化台物，需要通过具有双功能基团结构的整合剂，把Eu”与抗体连接起来。理想的螯台剂应该是：与Eu能形成稳定的络台物}具有以共价键与蛋白质结合的结构}标记抗体后，对抗体的免疫活性、溶解度、稳定性、亲合力或特异性影响不大，与血清成分有最小的非特异结合，在激发波长上有高的消光系数}能把激发能有效地转移到所螯合的Eu”上，且有高的量子产额，易于台成标记所需的衍生物[8，5，"。实际上，要同时满足标记抗体和产生高量子产额两方面的要求是有困碓的。所以在DELFIA系统中，把它们分开处理。先介绍标记用的螯台剂。

用于标记的螯台剂有；N一(P一异硫氰酸苯基)一DTTAC8)，氨基苯基一EDTAC~1)，氨基苯基一四氮杂环十二烷四醋酸[∞、异硫氰酸苯甲基一DTTAC133，1一(对一苯双氮)一EDTAC~43，二乙烯三胺五醋酸酐ct53，异硫氰酸苯基一EDTACI63等。它们有以下特点：有双功能基团结构}螯合镧系元素Eu等形成稳定的、在水中溶解度高的螯台物，当金属离子与整合分于为1：1时，稳定常数可达lO～1O／(L·too1)，再加上温和的反应条件，有利于保持抗体的免疫活性，多羧酸类螯台剂螯台Eu的效率高，能提高标记比活性，Eu。多羧酸整台物的荧光很弱但在低pH时，Eu“可以完全从配位体上解离下来，为下一步被另种螯台荆螯台创造了条件。

不同的螯合荆，标记比活性对抗体免疫活性构影响有明显差异。重氮化氨基苯基一EDTA是首先用于Eu标记的，当标记的比活性大于5Eu”／IgG时，会引起抗体凝集，免疫活性下降。但是当用异硫氰酸基取氨代基时，即使比活性达到15~20Eu”／IKG，也不会影响免疫活性和在水中的溶解度。P一异硫氰酸苯基-DTTA的Eu”螯合物比相应的EDTA衍生物更稳定，且在低PH下解离Eu“也更快。特别是N广(P一异硫氰酸苯基)一DTTA的Eu“整台物，Eu”的解离速度特别快，2分钟内即可完成。正因此，在近来的DELFIA中，几乎都使用N一(P一异硫氰酸苯基)一DTTA。

蔓光增强

Eu标记的免疫复合物在高pH(pH7～9)时发光极弱，这是因为像Nr(P一异硫氰酸苯基)一DTTA这样的螯台剂虽然能很好地屏敝Eu，但是其结构不能把激发能有效地转移到Eu”．许多作者报道，B一二酮一Eu。或B一二酮一Tb”络合物受激后会发强荧光。每个Eu”共有8个配位位点，而且每个Ett的配位体最多是兰个。每个B一二酮分子具有供配位的两个氧原子，三个这样的分子就占据了Eu周围的6个配位位点。这样所剩的2个位点就被水分子的氧所占据，对荧光形成严重猝灭。为此，加入一种协同荆三正辛基氧化膦(TOPO)，每个TOPO分子具有一个氧原子，这样，两个TOPO分子取代那两个：求分子，结果形成Eu“(二酮)3(TOPO)结构的复合物。当加入一种非离子型表面活性剂TritonX-100时，会形成一种微胶囊，它的内例为疏水端，能溶解脂溶性的=南体，外侧为亲水端，与永结台。‘这样，微胶囊有效地阻止了二酮体吸收的能量向水中发傲，而更多地转移给Eu“．在低pH(pH2～3)和存在过量的吸收配位体氟化二酮化合物时，Eu很快地从螯合荆的多羧酸中完全解离下来。这种解离Eu”、。增强荧光强度的低pH溶液称为增强溶液。解离所需的最佳pH值与B一二酮化台物韵性质有关。当用B一萘甲兢基三氟丙酮《~-NTA)时，pH在3．～3．3t：t4~，面梗用三甲基乙酰兰氟丙酮(PTA)时PH需太于4．对于Eu，虽佳的增强溶液组成是：p—NTA15gmo1．TOPOs0ptoo1．TritonX一100O．1，邻苯二甲酸一醋酸缓冲液(O．1mol／L)，pH3．2，它也可用于Sm。标记抗体。对于Tb”，最佳增强溶液组成是IPTAs0~tmol，TOPO5Otool，TritonX一1000．2，醋酸盐缓冲液(0．1mol／L)，pH4．5．它也可用于Eu”，Sm”和Dy”．还用于Eu和Tb”的双标记测量。新增强溶液的研究还在不断深入[竹]。综上所述，Eu”的荧光波长是由离予自身决定的，然而荧光的半衰期和强度却与配位体和所处微环境有关。增强液的应用使荧光强度得到很大增加，从而提高了灵敏度。但是增强液也容易受到污染，使本底升高。我们在实验}1观察到，配制增强液的水应是去离子石英亚沸三蒸水j试剂尽量用光谱纯的j所用容器常规处理后，再用1EDTA浸泡，并用三燕水反复冲净；分装容器还要密封良好，尽量减少空气中金属离子污染。

不少作者测定了甾体激素，如牛奶中的孕酮(】9]，血清和滤纸上千血斑中l7一a一羟基一孕酮(20]，血清中的类固醇(2t]，屎中未结合的雌激素和总雌激素(]及尿中雌酮一3一葡糖醛酸化物(23]。有的作者用于监视妇女卵巢功能和预测怀孕以及用非分离方法测定尿代谢物。用于测定病毒和细菌的报道也较多。如蜱致脑炎复合病毒抗原的分析c2]，应用标记重组融台蛋白测定免疫缺乏病毒抗体(，粪便中腺病毒和轮状病毒的同时测定【2钉，甩单克隆抗体测定pQtato~毒(2]，用BCPDA做螯合剂测定小肠腺病毒(28]。有的还谀I定了结合于纤维素的细菌(20]以及把抗生蛋白链菌素用于病毒和细菌杂交实验的DNA探针(30]。对肿瘤相关抗原的测定及评价的报道较多，例如，有的作者()对CA一50、SPAN—l和cA19-9在诊断胰腺癌中的应用进行了比较研究，也有用Eu”一nTPA标记的癌细胞测量NK细胞的活性(。。]。对游离甲状腺素、血清中总甲状腺素和甲状腺球蛋白的测定以及抗胰岛素抗体和前列腺索一Fra的测定报道更多，34)。近年来也发展了许多特殊应用，范围不断扩大。例如，蛋白酶活性[。__、白细胞介素一?(9)、7一甲荩～2脱鸟苷嗦唑[、稠环芳烃)、5-甲基一2脱氧胞苷[383以及神经长因了，39)的测定。不少作者正在研究在同一样品中同时测定多种分析物的可能性，显然这是很有吸f力的，41]。H前，我国的科技人员正在仪器、方法学及关键试剂和实验配套用品等各方面进行研究，虽然尚未形成系列商品，但在不少方面已取得了可喜的进展，前景是好帕。

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