小孔成像（六）——PSF和共焦显微镜
我们上一节介绍了PSF在x-z（axial）方向也是具有尺寸的，那么当我们的样品存在高低起伏时，我们无法在一个固定的焦距下得到整个样品的清晰图像。图像是样品和PSF卷积的结果，理解为样品上每个点都为点光源，每个点光源的像都是PSF，见图1，上部分为样品，下部分左侧为样品在XZ平面和PSF卷积后的结果，我们选取焦平面的位置成像，见图一下部分右侧，我们可以看到图像中有模糊的绿色背景。这是由其他位置的样品的PSF对z方向的影响。
那么我们如何只让在焦平面上的物体对像有贡献呢？下面我们介绍共焦显微镜。
扫描共焦显微镜
共焦显微镜的工作原理其实和SEM类似，也是扫描类型的成像技术。
一束激光（红色箭头）通过小孔（pinhole）之后，由二分镜发生反射，之后激光通过物镜，焦点在样品表面。激光打在样品之后，使得物体发出的光向上传播（绿色），穿透过二分镜之后，被探测器接收。那么由于在接收端存在一个pinhole，使得不在焦平面上物体产生的光被阻挡在外（蓝色阴影所示）。只有在焦距点上的物体对成像有贡献。通过扫描刚兴趣的区域，得到物体的像，
那么我们像看蓝色位置的像要怎么做呢，我们仅仅需要把物体的位置上下移动，让自己想看的位置在焦平面上即可。除此之外，我们还可以上下移动物体，让不同的位置在焦距上，将得到的图像放在软件中，可以得到3-D图像。
那么我的物体不发光怎么办，其实很多生物样品无法发光，通过对样品进行荧光染色，那么我们的物体就可以发光了。当然对于本身发光的半导体，并且发光波长在探测器的探测范围内，那么就不需要染料了。
pinhole的尺寸：
因为我们受衍射极限的控制，一般接收端pinhole的尺寸为2M*0.61λ/NA，其中M为放大倍数。一般共焦显微镜将该数值命名为1Airy Uniut（AU），是最小pinhole的物理尺寸。在实际调试中，我们先选择尺寸比较大的pinhole，找到焦距后，在用小的pinhole来获得更清晰的图案。
扫描是如何完成？
在图2的基础上，我们腹肌一个扫描镜，通过镜子的转动可以达到激光在样品上的扫描。
拓展：
Marvin Minsky在普林斯顿结束博士学习两年以后，1957在哈佛发明共焦显微镜。图4为其手稿。
参考资料：
[1]https://ibidi.com/content/216-confocal-microscopy
