显示去甲肾上腺素信号通路和药物干预示踪剂的荧光探针
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研究的背景
神经元之间的信号传递方式主要依赖于神经递质的分泌、传递和摄取。神经递质是神经元释放的化学物质，以特定的方式与特定的受体结合。神经递质和受体之间的相互作用通常是短暂的，持续时间从几毫秒到几分钟。然而，它的作用可能会在目标细胞发生持续数小时或数天，这可能会对身体产生巨大的影响。
近年来，随着社会压力的加大，抑郁症患者数量激增。根据世界卫生组织的数据，全球患有抑郁症的人数已超过2.64亿。抑郁症已成为全世界残疾的主要原因，也是全球疾病负担的主要来源。研究表明，抑郁症与大脑中去甲肾上腺素水平降低密切相关。
去甲肾上腺素是单胺类儿茶酚胺类神经递质合成的中枢物质，在苯乙醇胺N-甲基转移酶(PMNT)的作用下，由多巴胺(DA)和肾上腺素(EP)的酶促反应产生。可见，这三种单胺类神经递质的结构和性质相似，是通过酶促反应相继合成的。设计对去甲肾上腺素有特异性检测的方法工具迫在眉睫。
传统的神经递质检测方法主要依靠电化学分析和质谱分析，在体内的原位检测往往存在一定的局限性。在前期的研究中，作者初步发现去甲肾上腺素独特的2-氨基乙醇部分与碳酸盐发生级联亲核取代释放荧光团，从而实现去甲肾上腺素的特异性检测。此外，它还成功地应用于脑组织切片中去甲肾上腺素的双重免疫荧光标记。但是，该探针的水溶性和发射波长较短，限制了其进一步的应用。
本文的工作
方案 1
在这项工作中，作者实现了去甲肾上腺素在水溶液中的红色荧光检测，使用花菁作为荧光团来延长其发射波长，并引入磺酸盐来大大改善其水溶性(方案 1)。随后，该探针成功地标记了PC12细胞中的去甲肾上腺素小泡，并对高钾刺激下去甲肾上腺素的胞吐过程进行了成像。首次实现了氟西汀(一种典型的抗抑郁药)在体内引起去甲肾上腺素升高的原位显像。对抑郁症药物治疗的研究和筛选具有一定的现实意义。
(1)吸收和发射光谱
图 1
探针在675和775 nm处的紫外吸收随时间的推移而逐渐降低，而在550 nm处的紫外吸收则逐渐增加。相应地，加入NE后，体系的荧光强度在640 nm处逐渐增强。
(2)活细胞内源性去甲肾上腺素的显像
图 2
当20 μM探针与Hela细胞和HepG-2细胞在37 °C培养40 min时，未观察到荧光发射。研究表明，PC12细胞可以分泌富含去甲肾上腺素的囊泡，并具有胞吐作用。当然，当探针与PC12细胞在相似的条件下培养后，可以观察到明显的红色荧光发射，并随着时间的推移而增加(图 2)。结果表明，该探针可以标记囊泡中的去甲肾上腺素。
(3)去甲肾上腺素胞吐过程的成像
图 3
据报道，高浓度钾刺激细胞产生的动作电位可引起电压依赖性钙离子通道去极化，从而打开钙离子通道。在电化学势的驱动下，钙离子从细胞外流入细胞；细胞质中钙浓度的增加触发了囊泡与细胞膜的融合。因此，它刺激神经递质的释放。本工作用高K+溶液刺激PC12细胞，细胞内荧光点强度逐渐减弱，细胞内含有探针标记的去甲肾上腺素小泡。
在相同条件下，用PBS刺激细胞(不含钾离子)。红色通道中的荧光强度几乎没有变化(图 3)。结果表明，K+浓度升高导致细胞胞吐，该探针实现了去甲肾上腺素信号通路的可视化。
(4)去甲肾上腺素在脑组织中的可视化
图 4
如图 4所示，涉及探针(B1，B2)和DBH-AF350(C1，C2)荧光发射的面积显示出广泛的重叠(E1，E2)，表明探针具有对非肾上腺素能神经元的特异性标记能力。
图 5
此外，它仍然显示了通过DBH和PNMT的双重免疫标记将去甲肾上腺素标记为肾上腺素的探针(图 5)。这种双向检测策略有力地证明了该探针可以在组织水平高效、特异地标记去甲肾上腺素。
(5)活体荧光成像
图 6
如图 6所示，去甲肾上腺素组的红色通道信号随着时间的推移而增加，而对照组则没有明显变化。我们认为该探针可作为体内检测NE的有效工具，在神经递质和信号通路的定量分析中具有良好的临床应用前景。
(6)氟西汀去甲肾上腺素释放显像
图7
与腹腔注射等量生理盐水的大鼠相比，氟西汀治疗的大鼠脑内去甲肾上腺素水平明显高于对照组(图 7)。本研究结果为今后临床抗抑郁药物的筛选和疗效评价提供了科学依据。至此，我们将通过特异性荧光探针生物成像，研究各种抗抑郁药物在各种抑郁状态下的干预和治疗，并对其作用机制进行深入研究，为开发有效的抗抑郁药物提供有力的数据库。
文献原文：Zhou, N.; Huo, F.; Yue, Y.; Yin, C., Specific Fluorescent Probe Based on "Protect-Deprotect" To Visualize the Norepinephrine Signaling Pathway and Drug Intervention Tracers. J Am Chem Soc 2020, 142 (41), 17751-17755.
Doi：10.1021/jacs.0c08956
