为什么CRISPR没有成为目前基因治疗的首选技术？

CRISPR的热度在分子生物界持续了数年，而2020年的诺贝尔化学奖授予给了两位CRISPR的奠基者，更是将CRISPR的研究热潮推上了顶峰。

CRISPR实际是（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，成簇的有规律的间隔短回文片段）的简称。 1987年，科学家在大肠杆菌中发现了一段“无法确定功能”的DNA，这段DNA中有一些小片段具有几乎相同碱基排列方式，他们被一些排列方式多变的DNA隔开。当时, 科学家们并没有意识到他们已经探到了原核生物免疫秘密的边缘。

后来，科学家们获取了更多细菌基因组数据后，通过大量比较，鉴定出了位于CRISPR一侧的Cas1-4四种基因。

随着更深入的研究，科学家发现，CRISPR实际上与抵抗外来因子有关，细菌通过Cas蛋白获得免疫。当病毒将自己的DNA注入细菌的时候，Cas识别PAM（protospacer-adjacentmotif, 原间隔序列毗邻基序），接着就将其切割成小段，将前体间隔序列片段整合到CRISPR中，并遗传给自己的后代。若后期或者后代再次遭遇同种DNA入侵的时候，其转录产物便能识别入侵，并借助Cas基因表达的核酸酶清除入侵者的DNA。

利用这个发现，科学家改造CRISPR为基因编辑技术，改装tracrRNA-crRNA，使它与Cas9结合，当他们进入细胞核并识别PAM序列后，会在其后方3个碱基的地方切断DNA，并产生平末端切口。为了将编辑工具顺利转入细胞核，科学家探索出了在载体上插入核定位信号，以及电穿孔和利用病毒整合的方法。因为操作简单，CRISPR/Cas9在几年时间里成为分子生物学技术的热门。

其实在CRISPR之前，早有ZFN、TALEN两种基因编辑技术，而TALEN的特异性最高，是迄今商业化最成功的一项，今天的很多基因治疗项目也是倾向于选择TALEN的。那么，为什么不选择CRISPR呢？

这就需要了解到CRISPR的脱靶效应。

由于sgRNA配对结合区域碱基有限，也许能够配对的DNA片段在基因组里有数个，但如果把sgRNA的定位区设计过长，则有一部分会被剪掉，失去功能。并且在局部不配对的情况下，sgRNA的定位区也有可能与相似的DNA序列结合，导致切割错误的基因。sgRNA(crRNA)在靠近PAM的地方存在一段种子(seed)序列，如果种子序列发生任何错配，就能导致靶点切割效率大跌甚至消失殆尽。基因组越庞大的生物越危险，尤其是拥有31.6亿个碱基的人类。脱靶效应导致的后果，可能是错误的表型，更麻烦的可能是假表型——删除了错误的基因，却与删除目标基因产生了相同的表型。所以sgRNA的设计优化仍是一项长期工作。

今天，CRISPR在小鼠基因敲除上得到了应用，如果从这个方面与体内转染试剂比较，CRISPR依然存在周期长、失败率较高，每只小鼠成本高出几十倍的局限性。