免疫荧光染色技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
一、石蜡切片免疫荧光染色实验步骤
1.多聚甲醛固定组织脱水：75%酒精4h；85%酒精2h；90%酒精1.5h；95%酒精1h；无水乙醇Ⅰ0.5h；无水乙醇Ⅱ0.5h。
2.组织透明：组织块经酒精脱水后必须经过透明。透明剂（无水乙醇：二甲苯（1：1）溶液侵泡10min；二甲苯Ⅰ侵泡10min；二甲苯Ⅱ侵泡7min；）能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。
3.浸蜡：透明后的组织块依次经3缸石蜡（60℃）进行浸蜡。石蜡Ⅰ（60℃）1h，石蜡Ⅱ（60℃）1h，石蜡Ⅲ（60℃）1h。以上3个实验步骤都在生物组织脱水机里面完成。
4.包埋：包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡块中。包埋用蜡的温度应略高于浸蜡温度，保证组织块与包埋石蜡完全融为一体。
5.切片和烤片：切片前先将蜡块切面在冻台上冷冻几分钟，然后将所要切的包埋块固定在标本夹上，使包埋块外切面与标本夹截面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。，将刀台移至近标本台处，让刀口与组织切面稍稍接触。右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于42℃左右水浴展片锅中，用镊子将切片分开，然后用APES或多聚赖氨酸处理过的防脱玻片倾斜着插入水面去捞取切片，使切片贴附在载玻片的合适位置，于60℃ 烤箱烤片3个小时即可。
6.切片脱蜡：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ（10min）-二甲苯Ⅱ（10min）-无水乙醇Ⅰ（5min）-无水乙醇Ⅱ（5min）-95%酒精（3min）-90%酒精（3min）-80%酒精（2min）-70%酒精（2min），然后蒸馏水浸洗2min。
7.抗原修复：微波进行抗原修复，将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯中的不锈钢切片架上，加适量的修复液（0.01M枸橼酸缓冲液，pH6.0）于烧杯中，液面要浸过切片组织一定高度，微波炉可先用高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始计时，修复时间为10-15min。到时间后将烧杯从微波炉中取出，放入冷水中冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3遍，每次3min。
8.血清封闭：用吸水纸擦干玻片，免疫组画笔在组织周围画圈，滴加稀释好的正常山羊血清，室温封闭30min，以减少非特异性染色。
9.一抗染色：甩去多余液体，不洗，然后滴加稀释好的一抗，4°C湿盒中孵育过夜。 10.荧光二抗染色：PBST冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST冲洗切片4次，每次3min。
11.DAPI复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI。
12. 用吸水纸擦干切片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
二、细胞爬片免疫荧光染色实验步骤
1.在细胞培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min； 2.用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min； 3.0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min； 4.PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min； 5.吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
6.PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
7.DAPI复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；
8.用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
