科研助攻 | "肽肽风"？ 如何基于 DEL 环肽库进行筛选？ | MedChemExpress (MCE)
司美格鲁肽获批上市，全球刮起“肽肽风”。你知道吗？“肽肽”们也有帮派:线性肽和环状肽。更高的靶点亲和力、更好的代谢稳定性、更佳的生物膜透性……本期小 M 为大家介绍“好肽肽”环状肽联合 DEL 筛选如何破局 Mcl-1 成药难问题？
01 环肽：破局难成药蛋白！
逃避细胞凋亡对肿瘤的发展和生长至关重要，Mcl-1 (Myeloid cell leukemia 1)是 Bcl-2(B-cell lymphoma-2)蛋白家族中重要的抗凋亡蛋白之一，对肿瘤的生存起到关键的保护作用。开发 Mcl-1 抑制剂意味着需要阻断蛋白-蛋白相互作用，通常需要对结构更复杂更大的分子进行漫长的优化。 近日，荷兰的 Symeres 制药公司在药物化学 TOP 期刊JMC上介绍了通过 DEL 筛选发现新型 Mcl-1 抑制剂的全过程，小 M 将基于此研究跟大家分享该药物分子的开发过程。
图 1. 新型 Mcl-1 抑制剂的开发过程[1]。
文献要点：
- Mcl-1 的抑制需要阻断蛋白-蛋白相互作用，这通常需要相对比较大，结构复杂的(半)肽类化合物来实现。
- 使用 DNA 编码环肽库和 DEL 筛选来直接筛选结构复杂的大环化合物得到 3 个苗头分子，但是溶解性和透膜性差，以及活性需要进一步的提升。
- 通过配体-蛋白质结构解析确认苗头分子 cpd3 的构象。基于口袋分析，认为 P1’口袋可以进一步诱导，以此为重点改构方向提升分子活性以及优化分子的理化性质。
- 保持大环骨架不变，针对性的对 P1’口袋处的侧链进行优化。引入苯环进一步占据 P1’口袋，活性可以提升 100 倍，苯环上再引入柔性基团可以提升透膜性，引入杂原子或者新的基团降低 LogD，可以提高溶解性，最终得到 2 个先导化合物 57/59，适合未来进一步的开发用于疾病的治疗。
02 DEL 筛选：发现关键的苗头分子
在过去的 5-10 年里，文献(专利)中披露了一系列有潜力的 Mcl-1 选择性抑制剂，其中一些化合物已推入临床，但结果不是很理想，并且存在某些毒性问题。鉴于抑制 Mcl-1 的功能需要破坏蛋白-蛋白相互作用，大多数 Mcl-1 抑制剂的部分理化性质不符合 Lipinski 类药五原则，如 LogP, PSA 和 MW 等。
图 2 展示了过去十年报道的代表性的选择抑制剂，这些化合物都是从较小的非环分子演化来的，在先导物的发现和改构过程中存在着许多明显的挑战，而通过高通量筛选识别到有活性的大环分子需要异常庞大和多样化的化合物库，这通常只有 DNA 编码化合物库 (DEL)才能做到。
图 2. 不同类型的 Mcl-1 抑制剂结构[1]。
DEL 筛选这么牛，研究人员是怎么做到的呢？
▐ 第一步：DEL 建库。
该 DNA kit 由 21 种 DEL Library 混和而成，每个 Library 由一套独特的 DNA 兼容反应和一系列的分子砌块构建而成，库中每个分子以共价键的形式连接了一段记录其分离与合并过程并允许其识别的唯一的 DNA 序列。其中 1 个 Library 为一个环肽库，通过 4 轮建库而成，含有 15 亿的环肽分子。
▐ 第二步：DEL 亲和筛选。 研究人员分别做了 5 个筛选条件，筛选的蛋白分别是 Mcl-1(172−327)，Mcl-1(172−327)with 80 μM BIM peptide，Mcl-1 (33−327)，Bcl-xl(和 Mcl-1 属于同一家族，需要做出选择性)以及 No target(阴性对照)。
▐第三 ~ 四步：DNA 解码和数据分析。
通过深度测序对不同筛选条件的结果进行解码并分类统计分析，可以发现许多富集度很高的分子砌块组合在不同的筛选条件中都被鉴定出来。所有这些化合物在长和短的 Mcl-1 中都有富集，并且和 BIM 肽具有竞争关系，同时大多数富集化合物对脱靶蛋白 Bcl-xl 也有富集。可想而知发现选择性靶向 Mcl-1 而非靶向 Bcl-xl 的分子的困难性是很高的。
图 3b,3c 三维立方图 x 轴，y 轴代表不同建库阶段的分子砌块，Z 轴为富集结果，蓝色点为富集度好的含有 2 种分子砌块的系列分子 ，图 3d 为综合分析后，选出的选择性靶向 Mcl-1，且富集度好的一系列分子砌块信息，基于该信息可以推测出活性分子的结构。
▐第五步：off-DNA 合成和活性验证。
如图 3e 所示，DEL 筛选出的大环化合物(1/2/3)与 Mcl-1 具有可观的结合亲和力(50-130 nM)，且对 Bcl-xl 没有活性，是非常好的起始优化分子。同时因为这些分子属于半肽类分子，研究人员也测了代谢稳定性，结果表明这些分子具有足够的代谢稳定性用于下一步的分子改造。此外，这 3 个大环分子的细胞活性测试结果较差，同时溶解性也较差，因此接下来的工作主要在优化分子的细胞活性和理化性质上。
图 3. DEL 筛选发现苗头分子流程[1]。
(a) DEL 筛选工作流程，I：设计与合成 DNA 编码化合物库；II：通过亲和筛选找到和靶蛋白有亲和力的分子；III：使用深度测序 DNA 标签对选择输出进行表征；IV：通过统计分析鉴定富集化合物；V：合成代表性 Off-DNA 化合物；VI：生物活性验证。(b-c) 四环肽 DEL 库针对 Mcl-1 (172-327) 筛选的富集数据分析，蓝色点代表富集度好的化合物系列；(d)“SAR”信息体现富集度高的四轮建库分子砌块中。(e) Off-DNA 分子活性验证：aIC50values determined in an Mcl-1-BAK time-resolved fluorescence resonance energy transfer (TR-FRET) assay；bIC50values determined in an NCI-H929 cell viability assay；cIC50values determined in a Bcl-xl-BAK TR-FRET assay。
03 共晶结构：化合物改构的关键指导
如图 4，研究人员详细分析了化合物 1 和 Mcl-1 蛋白的结合模式，该大环分子在 P1-P4 口袋都占据，占据 P3, P4 口袋的片段相互作用比较多。
其中，Phe-Phg 片段占据 P4 口袋，苯丙氨酸侧链贴着由 Phe318/319 形成的疏水表面，同时占据了由缬氨酸 216、220、265 和甘氨酸 262 形成的小的疏水口袋。形成大环的肽链在该区域有不少的氢键作用，顺式氨基环己基乙酸片段位于 P3 口袋，其羰基与 His-224 形成氢键作用，同时该顺式构型对诱导分子其他片段更深入的进入 P1 口袋有非常重要的作用。
图 4. 化合物 1 与 Mcl-1 蛋白 (PDB_ID:8QSO) 复合物的 X 射线晶体结构[1]。突出显示不同的口袋：P1 (小麦色)，P2 (浅蓝色)，P3 (粉红色)和 P4 (淡绿色)；氢键为黄色虚线。
位于 P1 和 P2 口袋的片段形成的相互作用不是很多，主要是疏水作用。值得注意的是，研究人员发现许多已报道的 Mc1-1 抑制剂占据了 P1’诱导口袋，然而化合物 1 没有占据该区域，并且该诱导口袋看起来没有出现。
为了进一步研究 P1/P1’口袋，如图 5，研究人员将化合物 1 的复合物共晶结构与另一个 Mcl-1 抑制剂的共晶结构叠合，可以明显的看出 P1’口袋还有更多的优化空间，因此接下来的优化工作主要集中对 P1’口袋处的小分子侧链进行优化。
图 5. 化合物 1与 Mcl-1 蛋白共晶结构与已报道 Mcl-1 抑制剂复合物共晶结构叠合图 (PDB 5FDR)[1]。
(a). 比较可诱导的 P’口袋其闭合状态 (PDB：8QSQ，青色) 与开放状态 (PDB:5DFR，浅粉色)。(b). 化合物 1 (绿色) 和已报道的 Mcl-1 抑制剂 (橙色) 在 5FDR 蛋白中，显示诱导口袋的表面。
04 改构：提升活性，优化理化性质
如表 1，化合物(34-37)在 R 处引入苯环占据 P1 口袋，活性即有提升。化合物(38-42)引入更长的联苯炔，活性得到显著的提升。其中对叔丁基苯基衍生物 41 的酶活为 1.8 nM。
尽管酶活有所提升，但在细胞活性方面未观察到改善，在 H929 增殖和 Caspase 检测中，IC50值仍然在低微摩尔范围内。 研究人员假设是由于该大环分子的刚性结构以及联苯，联苯炔都缺乏柔性，从而透膜性不好，于是引入略微灵活的芳基醚来解决该问题，结果表明化合物 43 和 44 的酶活以及细胞活性都提升到纳摩尔级别。
表 1. P1’口袋取代基优化提升活性[1]。
虽然对 P1'-口袋的优化将活性提升 2 个数量级，但是 cLogD 显著增加，从化合物 3 的 5.1 增加到化合物 44 的 8.2，化合物 44 的溶解性低于 2 μM。因此，需要进一步优化分子整体的理化性质。
如表 2，基于前期的相互作用分析，主要对 R1，R2，R3 和 R4 基团进行微调，具体的方法主要是引入杂原子和极性基团来降低 cLogD。最终找到 57,59 这两个分子，具有可观的细胞活性，适当的透膜性和优秀的溶解性，适合未来进一步的开发用于疾病的治疗。
理化性质优化[1]。
MCE 的 DEL 库：
MCE 拥有 68 个多样性的 DEL 库，如优势骨架型、天然产物类似物型、环肽型、共价型等，含数十亿 DEL 分子，可进一步通过高通量测序技术，解码 DEL 分子的专属 DNA 标签，快速获得针对靶点的苗头化合物信息。这些 DEL 分子代表的化学结构新颖，化学空间覆盖范围广，具备类药分子特性。结合平台强大的 DEL 库个性化定制、重组蛋白定制、先导化合物优化技术及丰富的项目经验，MCE 可真正提供一站式 DEL 库及 DEL 库筛选服务。
05 小结
以上，小 M 给大家分享了一篇比较完整的基于 DEL 环肽库的筛选案例，希望可以帮助大家更进一步的了解 DEL 筛选~
参考文献： [1]. Hekking KFW, et al. Development of Potent Mcl-1 Inhibitors: Structural Investigations on Macrocycles Originating from a DNA-Encoded Chemical Library Screen. J Med Chem. 2024 Feb 22;67 (4):3039-3065.
